禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是引起禽大肠杆菌病的主要病原,该病临床主要表现为大肠杆菌性败血症、心包炎、肝周炎、气囊炎等,给世界养禽业带来了巨大的经济损失。APEC的毒力因子众多,其中,外膜蛋白是在宿主-病原体界面发挥核心作用的关键毒力因子。外膜蛋白T(Outermembraneprotein T,OmpT)是存在于大肠杆菌外膜的一种蛋白水解酶,属于Omptin外膜蛋白酶家族,可能在细菌感染宿主的粘附过程中发挥作用。大肠杆菌K12菌株染色体编码的OmpT是Omptin家族中第一个被解析结构的蛋白,该OmpT由10条反向平行的β折叠构成中空的桶状结构,从细菌外膜的脂质双分子层伸向细胞外。本实验室在研究中发现,APEC E058株(02血清型)既有染色体基因(compT)编码的 OmpT(cOmpT),也有 ColV 质粒基因(pompT)编码的 OmpT(pOmpT),cOmpT与pOmpT的氨基酸同源性高达73.6%。目前关于染色体编码的cOmpT研究相对充分,但质粒编码的pOmpT研究很少。本实验室的前期研究结果表明,cOmpT能够水解鱼精蛋白;pOmpT在APEC的致病中具有重要作用,却不具有cOmpT水解鱼精蛋白的能力。因此,我们有必要对pOmpT进行晶体学研究,以期从结构角度解析pOmpT和cOmpT功能差异的原因。在本研究中,我们构建了不含信号肽的pOmpT重组蛋白表达菌株BL21(DE3)pET30a-pompT并对该菌株进行诱导表达,获得了包涵体形式的pOmpT蛋白,体外变性和复性结果表明,获得的pOmpT目的蛋白在凝胶过滤层析后出现自水解,不利于后续结晶试验。根据相关文献报道,cOmpT蛋白进行K217G点突变后可以避免自水解,在此基础上,我们构建了 BL21(DE3)pET30a-popmT(K217G)和 BL21(DE3)pET30a-pompT(K217G)-His表达菌株,诱导表达获得了 pOmpT(K217G)和pOmpT(K217G)-His蛋白,发现二者同样可以有效避免自水解。带有His标签的蛋白可以在镍柱纯化的同时进行结晶去污剂交换,配合后续的凝胶过滤层析进一步纯化,为结晶实验作准备。我们对获得的高纯度蛋白进行了结晶条件初筛。对pOmpT(K217G)蛋白所生长的晶体进行衍射,均为假阳性盐晶,而pOmpT(K217G)-His基本均为蛋白晶体,故后续试验均以pOmpT(K217G)-His进行优化筛选。在对结晶条件MemMeso-17进行优化后,获得了衍射度约为7A的晶体,且该条件下的晶体生长稳定。我们对pOmpT蛋白稳定结晶条件的大量摸索,为最终获得pOmpT晶体结构并阐明pOmpT的生物学功能积累了宝贵数据。另外,我们还构建了含有cOmpT信号肽的BL21(DE3)pET30a-compT-His、BL21(DE3)pET30a-compT(K237G)-His 表达菌和含有 pOmpT 信号肽的 BL21(DE3)pET30a-pompT-His、BL21(DE3)pET30a-popT(K237G)-His 表达菌株,以野生株 E058 和空载体菌 BL21(DE3)pET30a为对照,测定了六个菌株对鱼精蛋白的水解能力。结果发现,未经突变的cOmpT能水解鱼精蛋白,而经K237G点突变(即不含有信号肽的K217G位点突变)的cOmpT不能水解鱼精蛋白,pOmpT无论是否突变,都不能水解鱼精蛋白。结果表明,K237氨基酸位点不仅在cOmpT和pOmpT蛋白稳定中发挥关键作用,且在cOmpT水解鱼精蛋白的酶活性中同样十分重要。