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类风湿性关节炎（Rheumatic arthritis,RA）是一种关节破坏性和慢性炎症性疾病,以侵蚀性和对称性的关节滑膜炎为特征,是目前严重威胁人类健康的临床难治疾病之一。羊踯躅（Rhododendron Molle G.Don）为杜鹃花科植物,其果实及花、根等部位均可入药,民间多用于治疗RA。现代临床应用亦证实,羊踯躅根对RA有较好的治疗效果,临床使用经验丰富。本课题组前期研究结果证实,羊踯躅具有镇痛、抑制佐剂性关节炎、抑制免疫反应等作用,其中二萜类成分为其主要药效及毒性物质基础。但是,羊踯躅毒性较大,且不同批次、不同药用部位中二萜类成分含量差异很大,这成为限制其临床应用和新药开发的瓶颈性问题。因此,本课题选择二萜类成分含量较高的羊踯躅果实为研究对象,以含量相对较高的代表性二萜类成分闹羊花毒素Ⅲ（Rhodojaponin Ⅲ,Rj-Ⅲ）、闹羊花毒素Ⅵ（Rhodojaponin Ⅵ,Rj-Ⅵ）为指标性成分,对其进行羊踯躅二萜有效部位（diterpenoid fraction from fruits of R.molle,DFRM）的成药性研究,具体如下:1羊踯躅二萜有效部位含量测定方法的建立本实验首次建立了以闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ为指标性成分的羊踯躅二萜有效部位高效液相-蒸发光散射（HPLC-ELSD）含量测定方法:采用乙腈（A）-0.3%甲酸水（B）流动相体系,洗脱梯度如下:0-5min,1%A;6-80min,5%A;81-100min,100%A;101-110min,1%A,流速为1.0 m L·min-1,进样量为50μL,选择蒸发光散射检测器,漂移管温度为55℃,气体流量为1.6 L·min-1,增益值为2,方法学考察结果显示,本含量测定方法准确、可靠、可重复,可用于羊踯躅果实以及羊踯躅二萜有效部位中闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ的含量测定。2羊踯躅二萜有效部位制备工艺研究本文首次建立了LSA-12S大孔树脂和正相硅胶两步柱色谱法从羊踯躅果实中获得羊踯躅二萜有效部位的制备工艺,最优工艺参数为:羊踯躅果实粗粉加8倍体积的70%乙醇,回流提取2 h,提取3次,合并提取液浓缩到原体积的1 4,静置12 h后以1000×g的离心力离心8 min,取上清液上样LSA-12S大孔树脂柱,上样体积为2 L上清液/L大孔树脂,上样量为1.3:1（果实生药量:大孔树脂质量）,上样流速2 BV·h-1,洗脱流速4 BV·h-1,径高比1:7,依次用5 BV去离子水、7 BV30%乙醇和5 BV 95%乙醇洗脱,收集含闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ明显点的溶液,旋干至恒重,同正相硅胶按质量比1:2拌样,上样正相硅胶柱,径高比1:10,硅胶用量30:1,依次用二氯甲烷:甲醇=20:1,10:1各洗脱12 BV,收集含闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ明显点的溶液,浓缩干燥至恒重,得羊踯躅二萜有效部位,其中指标性成分闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ总含量50-60%。本工艺简便可行、经济环保,有较好的工业产业化前景,工艺可行性良好。3羊踯躅二萜有效部位稳定性考察及质量标准研究本文对羊踯躅二萜有效部位进行了稳定性考察及质量标准研究。稳定性（影响因素试验、加速试验、长期试验）研究结果表明,高温是其稳定性主要影响因素,其他影响因素对指标性成分含量影响较小。此外,对羊踯躅二萜有效部位质量标准进行了制定,包括制法、性状、鉴别、检查、指纹图谱、含量测定、贮藏等内容,以便对其质量进行更好地控制。4羊踯躅二萜有效部位急性毒性研究本实验采用Bliss法对羊踯躅二萜有效部位进行急性毒性评价:计算其对昆明小鼠的LD50为4.0 mg·kg-1,其毒性小于闹羊花毒素Ⅲ单体(LD50=2.8 mg·kg-1)毒性。对死亡小鼠和正常小鼠进行解剖,发现各组织器官无明显变化。5羊踯躅二萜有效部位抗RA药效学评价本文选择CIA大鼠模型对羊踯躅二萜有效部位抗RA活性进行评价:实验结果显示,羊踯躅二萜有效部位高剂量(0.6 mg·kg-1·d-1)具有明显缓解CIA大鼠足肿胀程度（P<0.01）、降低关节炎指数（P<0.001）、降低促炎细胞因子TNF-α（P<0.001）、IL-1β（P<0.01）、IL-6（P<0.001）水平、抑制炎性细胞浸润、保护滑膜的作用,与阳性药雷公藤多苷(50.0 mg·kg-1·d-1)相比,其作用基本相当,表明其具有较强的抗RA活性;同时羊踯躅二萜有效部位治疗窗范围相对更大(羊踯躅二萜有效部位小鼠急毒LD50为4.0 mg·kg-1,雷公藤多苷LD50为100.0 mg·kg-1)。6羊踯躅二萜有效部位抗炎镇痛活性研究本实验采用经典的二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型、醋酸扭体法镇痛模型、热板法镇痛模型对羊踯躅二萜有效部位进行抗炎镇痛活性研究:羊踯躅二萜有效部位高剂量(1.2 mg·kg-1)具有明显抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀、减少醋酸引起的扭体次数、增加小鼠热板法阈值的作用（P<0.01）,效果同各阳性药作用接近,表明其抗炎镇痛活性良好。7羊踯躅二萜有效部位作用机制研究本文采用T、B淋巴细胞增殖实验,并结合CIA大鼠血清中细胞因子水平变化,对羊踯躅二萜有效部位作用机制进行探索:羊踯躅二萜有效部位中、高浓度(0.3 mg·m L-1、1.0 mg·m L-1)能够显著抑制T、B淋巴细胞的异常增殖（P<0.01）;同时,在抗RA活性研究中,羊踯躅二萜有效部位高剂量(0.6 mg·kg-1·d-1)能够明显降低促炎性细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的水平。以上结果表明,羊踯躅二萜有效部位抗RA作用应与其免疫作用和抑制促炎性细胞因子生成相关。本文首次建立了羊踯躅果实以及羊踯躅二萜有效部位中闹羊花毒素Ⅲ、Ⅵ的HPLC-ELSD含量测定方法,方法精确、稳定、重复性好;本文首次建立了羊踯躅二萜有效部位的制备工艺并制定了羊踯躅二萜有效部位质量标准草案,利用现代色谱技术,首次从羊踯躅果实中获得成分明确、质量可控、指标性成分含量50-60%的羊踯躅二萜有效部位,所得制备工艺经济、环保、简单,可用于工业化生产;在此基础上,本文利用经典的CIA大鼠实验和抗炎镇痛动物实验完成了羊踯躅二萜有效部位药效学评价,结果显示,羊踯躅二萜有效部位能够有效缓解CIA大鼠RA病情、在抗炎镇痛实验中表现良好活性,其作用与雷公藤多苷基本相当,但羊踯躅二萜有效部位具有相对更安全的治疗窗范围。综上所述,羊踯躅二萜有效部位的工艺可行性和抗RA药效学活性良好,具有较好的抗RA成药前景。