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肺癌是全球发病率第二、死亡率第一的恶性肿瘤,其发病率占癌症总发病率的11.4%,死亡人数占总死亡人数的18.0%。近年来随着诊断技术的提高以及胸腔镜、靶向及免疫治疗的使用,肺癌患者的生存率有着显著的提高,其3年生存率从2001年的19%上升到2004年的21%,再到2015年至2017年的31%,中位生存时间也从8个月增加到13个月。而在我国肺癌仍然是发病率以及死亡率最高的疾病,据估计2022年我国新发肺癌病例数约870982,占癌症总人数的18%,预计死亡人数占总死亡人数的23.9%。在肺癌中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占到绝大多数,所以其发生、发展的机制仍有待于进一步研究。环状RNA是一类通过反向剪接等机制形成的环状非编码RNA,由于其特殊的环状结构,所以较线性的m RNA更能够耐受RNase R酶的消化,表达更加稳定。最近的研究表明在肿瘤中也发现了大量差异表达的环状RNA,其表达量与肿瘤的TNM分期显著相关,对肿瘤的增殖迁移以及侵袭能力有显著影响。随着研究的增加,大量环状RNA在肺癌中的作用被阐明,但是这些研究主要集中在mi RNA海绵机制上,对于环状RNA与蛋白相互作用、翻译成蛋白等机制仍缺乏相关的研究。为了进一步阐明环状RNA在肺癌中的作用,我们首先利用三对NSCLC及癌旁组织进行环状RNA的高通量测序,共发现环状RNA 9442个,其中差异表达的1114个（|log FC|≥0.585;p＜0.05）,通过与GSE112214取交集及q RT-PCR验证后,最终筛选到hsa＿circ＿0001523（circ ZNF608）进行后续研究,探讨其对NSCLC增殖迁移及侵袭等功能的影响,为肺癌提供潜在的治疗靶点。本课题分为下面四个部分进行:第一部分CircZNF608的筛选及临床相关性分析方法:1、在3对NSCLC及癌旁样本中进行环状RNA的高通量测序,并进行差异分析。2、使用q RT-PCR在NSCLC样本中验证环状RNA的表达。3、设计发散引物（divergent primers）及收敛引物（convergent primers）,在g DNA和c DNA中进行PCR扩增,通过凝胶电泳分离扩增产物,并送sanger测序,验证circ ZNF608的存在。4、用放菌素D及RNase R酶分别处理NSCLC细胞系,检测circ ZNF608的半衰期及稳定性;用核质分提、荧光原位杂交实验（FISH）证明circ ZNF608的亚细胞定位。5、收集上述35例病人的临床信息,分析circ ZNF608的表达量与临床病理特征之间的关系。结果:1、NSCLC中共检测到9442个环状RNA,其中86.6%是由外显子反向剪接而形成。差异表达的环状RNA有1114个,包括620个上调及494个下调。2、通过与GSE112214取交集后,共得到三个下调的环状RNA,通过q RT-PCR验证发现,circ ZNF608在NSCLC中下调最为明显。3、CircZNF608是由ZNF608基因的外显子2反向剪接形成,全长为256nt。4、CircZNF608的半衰期超过12小时,能够耐受RNase R酶的消化,且主要分布于细胞质中。5、CircZNF608的表达量与肿瘤的T分期显著相关。结论:CircZNF608在NSCLC中显著下调,与T分期显著相关,并主要分布于细胞质中。第二部分CircZNF608对NSCLC细胞功能的影响方法:1、通过q RT-PCR检测正常支气管上皮细胞BEAS-2B及NSCLC细胞系中circ ZNF608的表达水平,利用慢病毒,构建circ ZNF608过表达及敲减的稳转株。并验证表达。2、CCK8及EDU检测circ ZNF608对NSCLC细胞增殖能力的影响;使用划痕实验及Tranwell实验检测circ ZNF608对NSCLC细胞迁移及侵袭能力的影响。3、使用过表达circ ZNF608的NSCLC细胞系,构建裸鼠皮下成瘤及肺转移的模型,观察在体内circ ZNF608对肿瘤细胞增殖、转移能力的影响结果:1、与正常支气管上皮相比,circ ZNF608在NSCLC细胞系中显著下调。2、CircZNF608在体外显著抑制NSCLC细胞的增殖迁移及侵袭能力。3、CircZNF608在体内显著抑制肿瘤的增殖及转移。结论:CircZNF608显著抑制NSCLC细胞增殖迁移及侵袭能力。第三部分CircZNF608通过结合IGF2BP3发挥作用方法:1、使用CSCD及Circinteractome预测circ ZNF608能够结合的mi RNAs,CSCD及Starbase预测circ ZNF608结合的RBPs,通过CircRNADb网站预测circ ZNF608编码蛋白的可能;2、通过RNA pull-down及RIP实验证实circ ZNF608与蛋白的结合;3、FISH、免疫荧光分别验证circ ZNF608、RBP的亚细胞定位;4、从TCGA及CPTAC数据库下载NSCLC肿瘤转录组、蛋白组及临床信息,研究IGF2BP3在NSCLC中表达及与临床性状关系,通过Kaplan-Meier Plotter分析IGF2BP3与预后关系;5、从xena browser网站下载泛癌数据,对IGF2BP3进行泛癌分析;6、利用String数据库及Metascape数据库构建IGF2BP3的PPI互作图,并进行富集分析。结果1、CircZNF608在NSCLC细胞中结合IGF2BP3;2、CircZNF608及IGF2BP3共定位于细胞质;3、IGF2BP3在NSCLC中显著高表达,且与肿瘤T、N分期及预后显著相关;4、IGF2BP3在多种肿瘤中显著高表达,并与预后较差相关。结论:CircZNF608通过结合IGF2BP3发挥作用。第四部分CircZNF608通过竞争性结合IGF2BP3下调MYC表达方法:1、使用实时定量PCR及WB验证IGF2BP3过表达及敲减的效率,CCK8及EDU检测NSCLC细胞增殖能力的改变;使用Tranwell实验及划痕实验检测NSCLC细胞迁移及侵袭能力的变化;2、WB检测过表达或敲减circ ZNF608对IGF2BP3表达量影响,实时定量PCR验证IGF2BP3过表达或敲除对circ ZNF608表达影响;3、cat RAPID网站预测circ ZNF608与IGF2BP3的结合位点,通过构建带Flag标签的IGF2BP3截短质粒及RIP实验,证实circ ZNF608与IGF2BP3的结合位点;4、利用GEO数据库数据、SRAMP网站及RMbase网站预测circ ZNF608上m6A甲基化修饰位点,通过Me RIP、RIP及荧光素酶报告基因实验验证;5、通过查阅文献寻找IGF2BP3的靶基因,通过q PCR、WB验证circ ZNF608及IGF2BP3对靶基因的含量的影响;6、利用RIP、放线菌素D及荧光素酶报告基因实验检测circ ZNF608对IGF2BP3结合MYC m RNA的影响;7、Ualcan数据库分析基因在NSCLC中的差异表达及基因启动子甲基化水平。结果:1、IGF2BP3在体外显著促进NSCLC细胞增殖迁移及侵袭;2、过表达circ ZNF608能够抑制IGF2BP3的促癌作用,敲减circ ZNF608能够拯救IGF2BP3降低后的抑制作用;3、IGF2BP3和circ ZNF608两者在表达量上无明显相互影响;4、CircZNF608结合IGF2BP3的KH3-4结构域;5、CircZNF608通过m6A甲基化修饰与IGF2BP3结合;6、CircZNF608竞争性结合IGF2BP3降低MYC表达;7、CircZNF608降低IGF2BP3与MYC m RNA的结合及m RNA稳定性;8、在NSCLC中DNMT1、DNMT3b表达增加,ZNF608基因启动子甲基化水平显著升高。结论:CircZNF608通过m6A甲基化修饰竞争性结合IGF2BP3,下调NSCLC细胞中MYC表达。