研究背景扩张型心肌病（Dilated cardiomyopathy,DCM）是一种原因不明的特发性心肌疾病,其主要临床特征为左或右心室或双侧心室扩大,伴有心室收缩或舒张功能障碍。DCM是进行性难治性心力衰竭的主要原因,在疾病的任何阶段都可发生死亡。儿童DCM的年发病率约占儿童心肌病的50%（0.57/100000）,是最常见的儿童心肌病。DCM儿童死亡率高,大多数死于心力衰竭,但目前DCM的发病机制尚未完全阐明。DCM患儿中有家族聚集的现象,表明遗传因素在其发病机制中发挥了一定作用。近年来,研究证实家族性扩张型心肌病占DCM病例总数的20%～50%。目前已经发现越来越多的基因突变与DCM高度相关,但一般来说可能只占遗传原因的一小部分,其中常染色体显性遗传占所有基因突变的90%。先前研究支持的另一个假说表明,亚急性和慢性病毒性心肌炎后未能消除病原体或激活针对心脏抗体的慢性自身免疫机制,可能最终促进心肌炎向DCM的转化。因此,进一步阐明其病因和发病机制对临床和科研具有重要意义。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的RNA,位于细胞核或细胞质内,可以从基因组中转录,不能翻译成蛋白质,但可以通过与DNA、RNA或蛋白质的相互作用来履行多种分子功能,如信号传导、诱饵、引导和支架等。近年来,越来越多的研究表明lncRNA在心肌梗死、心肌肥厚和纤维化、动脉粥样硬化、血管生成和血管重塑等心血管疾病中起着至关重要的作用。此外,lncRNA微阵列芯片是高通量分析lncRNA表达的有效工具,已被用于研究lncRNA在多种疾病中的表达谱。然而,lncRNA与儿童DCM的关系仍有待研究,尚未有相关的文献报道。目的通过微阵列分析研究lncRNA在DCM儿童和健康儿童外周血白细胞中的表达水平,筛选DCM特异性的lncRNA,并研究其在不同左室功能的DCM儿童中是否存在表达差异,从而发现新的DCM生物标志物,同时为DCM的发病机制研究提供线索。方法本研究共收集2019年03月01日到2019年12月31日在山东省立医院儿科就诊的45例DCM患儿以及25例健康儿童的外周血白细胞,在45例DCM患儿中包括25例心功能减低DCM患儿和20例心功能改善的DCM患儿。我们在DCM心功能减低组中选取了其中3例DCM组和3例健康儿童采用深圳中科普瑞生物技术有限公司的Sino human ceRNA array V3.0芯片分析差异表达的lncRNA以及mRNA。随后对差异表达的lncRNA和mRNA进行生物信息分析,包括GO富集分析、KEGG pathway 分析、lncRNA 的 cis/trans 靶基因预测、lncRNA-mRNA 共表达网络和lncRNA-miRNA-mRNA互相作用网络等。最后通过qRT-PCR分析验证微阵列分析的准确性。结果1.通过微阵列分析,共检测到DCM患儿和健康儿童中存在75589个lncRNA,与对照组相比,DCM患儿共检测到874个lncRNA差异表达（差异倍数≥2,p<0.05）,其中369个上调,505个下调。DCM组和对照组之间有641个差异表达的mRNA,其中包括482个上调和159个下调的mRNA。2.通过GO富集分析,在lncRNA的三种不同基因功能中,我们筛选了富集因子排在前20位的GO条目,其中分子功能为生物途径居多,这些条目包括IgG结合、免疫球蛋白结合、调节β-干扰素的产生、干扰素-β生产、反转运蛋白活性、成骨细胞分化的积极调控、Notch信号通路的调控、调节成骨细胞分化、蛋白酶结合、干扰素γ产生的调节、调节Ⅰ型干扰素的产生、半胱氨酸型内肽酶活性的激活、Ⅰ型干扰素生产、干扰素γ的产生、骨矿化、质膜的外在成分、有机阴离子跨膜转运蛋白活性、磷酸酶结合、对生物碱的反应和酶原激活等。3.在KEGG pathway分析中,我们选择了与免疫反应相关且与DCM有关的通路,即“NF-κB信号通路”、“Toll-like受体信号通路”、“PPAR信号通路”、“MAPK信号通路”、“凋亡”、“NOD样受体信号通路”等。随后,我们在这些通路中筛选了差异表达的基因。4.我们从顺式和反式的作用方式,进行了 lncRNA的靶基因预测。结果证明,lncRNA在“NF-κB信号通路”、“Toll-like受体信号通路”和“凋亡”等通路中可能参与在转录水平上的调控。5.我们构建了 lncRNA-mRNA共表达网络,在上述途径中鉴定了 120个lncRNA 和 22 个 mRNA（Pearson 系数>0.98）。LncRNA-mRNA 网络由 142 个网络节点和149个连接组成,每个lncRNA连接到1～3个mRNA,每个mRNA连接到1～18 个 lncRNA。其中,TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、IL-6、IL1R1、IL1B、IL1RAP、ACSL4、CASP1、CASP5、MAP2K6、TAB3 等 mRNA 在 DCM患儿中发挥重要作用。6.我们利用生物信息分析软件（Cytoscape）V3.6.0预测出每个lncRNA的结合潜力最高的前5个miRNA。我们根据上述选择的通路中差异表达的mRNA的功能选择了相应差异表达的lncRNA,这些mRNA可能由可以竞争性结合相应miRNA 的 lncRNA 调控。其中预测 NONHSAT215378.1 可能与 hsa-miR-4485-3p互相作用,对mRNAFBXO32进行负向调控。并且利用这些信息,我们应用Cytoscape 构建了 ceRNA 网络。7.我们筛选出了 9个lncRNA分子,其中5个上调,4个下调。经过qRT-PCR分析发现,与正常对照组健康儿童相比,DCM患儿中NONHSAT242978.1和ENST00000637940的结果与微阵列数据显示的趋势相反。其他7个lncRNA中,3 个上调（ENST00000560465、NONHSAT252242.1、ENST00000457996）和 4个下调（NONHSAT175499.1、ENST00000596816、NONHSAT215378.1、NONHSAT137060.2）均与微阵列数据结果的趋势一致,且具有统计学意义（p<0.05）,微阵列数据的准确性得到了验证。8.我们验证了这些lncRNA在心脏功能差的DCM患儿和心功能改善的DCM患儿中的表达水平,结果表明,与DCM心功能减低组相比,只有NONHSAT252242.1、ENST00000596816、NONHSAT215378.1、NONHSAT137060.2在DCM心功能改善组中有显著差异（p<0.05,差异倍数>2）。这一发现表明这些分子的表达不仅可能与DCM的诊断有关,还可能与DCM的严重程度相关,并且可以用作生物标志物,以测量将来DCM的恢复程度。结论1.在DCM患儿的外周血中,lncRNA和mRNA存在表达差异,可能参与儿童扩张型心肌病的发生发展。2.在儿童DCM中,lncRNA可能主要通过调节免疫系统相关信号通路发挥作用。3.DCM 患儿外周血中 lncRNANONHSAT252242.1、ENST00000596816、NONHSAT215378.1、NONHSAT137060.2可能是诊断儿童DCM,初步反映病情发展的生物标志物。