一、研究背景气道平滑肌细胞(Airway smooth muscle cell, ASMC)异常过度增殖是支气管哮喘(哮喘)气道重塑的重要特征。自1922年首次在尸检中发现哮喘致死患者的气道平滑肌层显著增厚,接下来的众多研究也证实了各阶段哮喘患者均存在不同程度的气道平滑肌容量增加。增厚的气道平滑肌收缩能力增强,且对变应原的反应性增加；同时平滑肌层增厚导致气道管径变窄,气流受限程度加剧。气道平滑肌过度增殖与哮喘严重程度相关,是导致气流受限向不可逆发展的关键环节。目前治疗哮喘的瓶颈在于,虽然糖皮质激素、支气管舒张剂能够很好地控制和缓解哮喘发作,但无法阻止和逆转不可逆气流受限的发展。抑制气道平滑肌增殖可能成为治疗哮喘的新靶点,因此,研究ASMC增殖的机制十分必要。在哮喘的炎性气道环境中,多种因素可引起ASMC增殖增加,主要有：生长因子、细胞因子、炎症介质、以及多种酶类。这些有丝分裂原作用于细胞膜上的相应受体,引起下游一系列信号通路的激活,其中研究的最多的是细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)通路。细胞外信号经传导、放大、整合后入核,导致转录因子释放,细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达,推动细胞进入有丝分裂周期而完成增殖过程。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(RAS)的重要成员,以往认为其主要作用是调节血压及体液平衡。近年来的大量研究证实,AngⅡ还与细胞增殖、凋亡、迁移、分化、炎症反应及免疫调节等多种生物学行为有关。有研究表明,哮喘发作时伴有肺脏局部RAS的活化,血浆AngⅡ水平升高。AngⅡ与ASMC增殖是否存在关联,目前的研究结果并不明确,且其机制尚未充分阐明。本研究将Ang Ⅱ、Ang Ⅱ受体拮抗剂Losartan、ERK激酶抑制剂PD98059分别或同时作用于原代培养的人ASMC,从活细胞酶水平、细胞周期两个层面检测细胞增殖情况,检测Cycling D1mRNA及蛋白表达水平,并检测ERK磷酸化水平,旨在探讨AngⅡ对ASMC增殖的影响并初步探讨其作用机制。二、研究目的1.原代培养人ASMC,并观察其在体外培养时的特点,并鉴定所培养的细胞为平滑肌细胞；2.探讨AngⅡ对人ASMC增殖的作用,并观察AngⅡ受体拮抗剂Losartan、ERK激酶抑制剂PD98059对上述作用的影响；观察AngⅡ对人ASMC细胞周期的影响,及Losartan、PD98059的作用；3.分别从mRNA及蛋白水平检测AngⅡ对人ASMC细胞周期蛋白D1(CyclinD1)表达的影响,及Losartan、PD98059的作用；4.检测AngⅡ对人ASMC细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化水平的影响,及Losartan、PD98059的作用；三、研究方法(一)人气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.原代培养：取肺叶切除术患者手术标本,无菌条件下分离叶、段支气管中膜平滑肌层,剪成约1mm3大小贴于培养瓶底,间隔约0.5cm,加入含20%胎牛血清的DMEM,置37℃、5%CO2孵箱中培养；2.传代培养：待细胞从组织块周围爬出并生长融合,占培养皿底面积的70～80%时,以1：2～1：4传代于培养瓶,用含10%胎牛血清的DMEM培养；3.细胞纯化：细胞纯化采用机械刮除法、差异贴壁法及自然纯化；4.细胞鉴定：用免疫荧光法对所培养细胞进行平滑肌特异的α肌动蛋白(a-SMA)特异性染色,鉴定其是否为平滑肌细胞；5.后续处理：取3-6代对数生长期细胞,以5×103/孔接种于96孔培养板或1×104/cm2接种于培养皿,用于实验研究：(二)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞增殖的影响1.细胞准备：按上述方法接种于96孔板的细胞用于MTT(四甲基偶氮唑盐)法细胞增殖检测,接种于60mm培养皿的细胞用于细胞周期检测；2.浓度梯度：以10-8～10-Smol/L浓度梯度的AngⅡ作用于细胞24h,检测细胞增殖情况,观察各个浓度AngⅡ对细胞增殖的影响；3.分组：细胞随机分为对照组、AngⅡ组、Losartan组、AngⅡ+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组,给予相应干预剂刺激24h后,进行增殖检测；4.增殖检测(MTT法)：培养结束后用多功能酶标仪检测各组490nm波长处吸光度值,以A490表示；5.细胞周期检测：流式细胞术PI单染法分析处于细胞周期不同阶段的细胞百分比；6.统计分析：各组数据用(x±s)表示,方差齐时多组间比较采用F检验,多重比较采用q检验,方差不齐时方差分析采用Welch法,多重比较采用Dunnett T3法。检验水准为a=0.05,P≤0.05为差异有统计学意义；(三)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞周期蛋白D1表达的影响1.细胞准备：上述细胞接种于35mm/60mm培养皿,生长至培养皿底面积70-80%时用于提取总RNA或蛋白；2.分组：同第二部分,给予相应干预剂处理24h；3.检测Cyclin D1mRNA表达：用接种于35mm培养皿中的细胞提取细胞总RNA,并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR对Cyclin D1特异性片段进行扩增,读取各组CT值,计算2-ΔΔCT表示Cyclin D1mRNA相对表达量；4.检测Cyclin D1蛋白表达：用接种于60mm培养皿中的细胞提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组Cyclin D1蛋白表达水平,以β-actin作为内参,计算CyclinD1与β-actin条带灰度值之比表示Cyclin D1蛋白表达水平；5.统计分析：数据以(x±s)表示,进行方差分析比较组间差异,方差齐时采用F检验,多重比较采用q检验,方差不齐时采用Welch法,多重比较采用DunnettT3法。检验水准为a=0.05,P≤0.05为差异有统计学意义；(四)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞细胞外信号调节激酶通路的影响1.细胞准备：细胞接种于60mm培养皿,生长至培养皿底面积70-80%时进行信号通路检测；2.分组：同第二部分,给予相应干预剂处理24h；3.检测ERK及磷酸化ERK (p-ERK)水平：提取细胞总蛋白,Western Blot检测各组ERK及p-ERK水平,计算p-ERK与ERK条带灰度值之比表示ERK磷酸化水平,即ERK通路活化情况；4.统计分析：数据以(x±s)表示,进行方差分析比较组间差异,方差齐时采用F检验,多重比较采用q检验,方差不齐时采用Welch法,多重比较采用DunnettT3法。检验水准为a=0.05,咫0.05为差异有统计学意义。四、结果(一)人气道平滑肌细胞原代培养及鉴定1.2-3周后,贴于培养瓶底部的平滑肌组织块周围陆续可见细胞爬出,普通光镜下观察,细胞贴壁生长,呈长梭形,卵圆形胞核位于细胞中央,可见1个或多个核仁；2.细胞继续生长1周左右,相邻组织块爬出的细胞开始融合,传代后12h观察,细胞贴壁良好,2-3天后融合,排列规律呈典型“峰谷征”；3.细胞免疫荧光染色95%以上细胞α-SMA表达阳性；4.以5×103/孔接种于96孔培养板或1×104/cm2接种于培养皿,24h后可覆盖培养物底部面积的70-80%；(二)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞增殖的影响1.浓度梯度实验显示：对照组、10-8、10-7、10-6、10-6、10-5mol/L浓度组细胞-90值分别为：0.396±0.029、0.416±0.035、0.500±0.050、0.483±0.059、0.450±0.051；与对照组相比,10-7～10-5mol/L浓度的AngⅡ均可引起ASMC增殖显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),其中10-7moI/L浓度的AngⅡ作用最为明显；2.不同干预剂作用24h后,对照组、AngⅡ组、Losartan组、AngⅡ+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组细胞A490值分别为：0.386±0.021、0.531±0.043、0.380±0.019、0.395±0.018、0.393±0.024、0.389±0.028,其中Ang Ⅱ组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01),Losartan组及PD98059组与对照组差异无统计学意义,Ang Ⅱ+Losartan组及AngⅡ+PD98059组低于AngⅡ组,差异有统计学意义(均P<0.01)；3.对照组、AngⅡ组、Losartan组、Ang Ⅱ+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组细胞G0/G1期细胞百分比分别为：89.0±3.1、81.2±3.1、89.4±1.9、90.4±1.6、89.6±1.8、88.1±2.9；S期细胞百分比分别为：1.6±0.6、3.9±0.6、1.8±0.4、1.6±0.3、1.7±0.5、2.0±0.7；G2/M期细胞百分比分别为：9.4±2.6、14.9±2.6、8.9±1.8、8.1±1.6、8.7±±1.5、9.9±2.3,与对照组比较,AngⅡ组GOG1期细胞减少,S、G2M、S+G2M期细胞增多,差异有统计学意义(均P<0.01)；与Ang Ⅱ组比较,Ang Ⅱ+Losartan组GOG1期细胞增多,S、G2M、S+G2M期细胞减少,差异有统计学意义(均P<0.01)；AngⅡ+PD98059组GOG1期细胞增多,S、G2M、S+G2M期细胞减少,差异有统计学意义(均P<0.01)(三)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞周期蛋白D1表达的影响1.不同干预剂作用24h后,对照组、AngⅡ组、Losartan组、Ang11+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组Cyclin D1mRNA相对表达水平分别为：1.00±0.17、1.57±0.26、0.95±0.09、0.91±0.21、0.77±0.09、0.84±0.04,与对照组相,比,AngⅡ组Cyclin D1mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.01), Losartan组及PD98059组与对照组差异无统计学意义,与AngⅡ组相比,AngⅡ+Losartan组及AngⅡ+PD98059组Cyclin D1mRNA表达降低,差异有统计学意义(均P<0.01)；2.干预剂作用24h后,对照组、AngⅡ组、Losartan组、AngⅡ+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组Cyclin D1蛋白表达水平分别为：0.224±0.074、0.527±0.082、0.312±0.036、0.291±0.094、0.286±0.059、0.226±0.047,与对照组相比,AngⅡ组Cyclin D1蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),Losartan组及PD98059组与对照组差异无统计学意义,与AngⅡ组相比,AngⅡ+Losartan组及AngⅡ+PD98059组Cyclin D1蛋白表达降低,差异有统计学意义(均P<0.01)；(四)血管紧张素Ⅱ对人气道平滑肌细胞细胞外信号调节激酶通路的影响1.不同干预剂作用15min后,对照组、AngⅡ组、Losartan组、Ang Ⅱ+Losartan组、PD98059组、AngⅡ+PD98059组ERK磷酸化水平分别为：0.306±0.049、0.641±0.153、0.245±0.053、0.212±0.073、0.221±0.036、0.211±0.060,与对照组相比,Ang Ⅱ组ERK磷酸化水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),Losartan组及PD98059组与对照组差异无统计学意义,与Ang Ⅱ组相比,Ang Ⅱ+Losartan组及AngⅡ+PD98059组ERK磷酸化水平降低,差异有统计学意义(均P<0.01)。五、结论1.组织块贴壁法培养ASMC周期约为1个月,5×103/孔接种于96孔培养板或1×104/cm2接种于培养皿是合适的接种密度；细胞经免疫荧光染色鉴定,表达平滑肌特异的a-SMA,纯度达95%；2. Ang Ⅱ可引起人ASMC增殖增加,以10-7mol/L浓度作用最为明显；AngⅡ处理组较对照组细胞总数增加,同时处于GOG1期的细胞百分比减少,S及G2M期细胞百分比增加；阻断AngⅡ受体或ERK信号通路均可逆转AngⅡ的促增殖效应；3.AngⅡ可诱导人ASMC Cyclin D1mRNA及蛋白合成增加；阻断AngⅡ受体或ERK信号通路均可消除AngⅡ对CycIin D1的影响；4.AngⅡ可活化ERK通路,使ERK磷酸化水平升高；AngⅡ受体阻断剂Losartan及ERK抑制剂PD98059可抑制上述效应。