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哺乳动物骨骼肌的分化过程是由肌源性调控因子(Myogenic Regulatory Factors,简称MRFs)控制的精密网络,并且这些肌源性调控因子的精确表达是骨骼肌前体细胞分化的必需条件之一。最近的研究表明microRNAs(简称miRNAs)在控制骨骼肌分化方面发挥着重要的作用。miRNAs通过结合于靶基因的3’-UTR从而导致靶基因mRNA的翻译抑制或者是mRNA降解。在本研究中,我们发现miR-214可以促进小鼠的肌源性母细胞C2C12向骨骼肌方向分化,并且于p21和myogenin表达上调之前起作用。利用2’-0-甲基化的抑制性oligos可以阻断miR-214的作用,阻断miR-214的作用可以使C2C12细胞维持活跃的细胞周期,从而避免分化。通过全基因组分析,我们发现原癌基因Nras是miR-214的一个功能性靶基因。用si-Nras抑制Nras的表达可以增强miR-214的作用,而用腺病毒介导的Nras过表达则可以减弱miR-214的作用。综上所述,我们的研究揭示了一个新的调控骨骼肌分化的非肌肉组织特异性microRNA,即miR-214。横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,简称RMS)是一种起源于骨骼肌系统的肿瘤。根据组织学特点,RMS可以分成两种主要类型：腺泡型和胚胎型。腺泡型是由小而圆的致密细胞组成,主要发生于躯干和四肢,预后较差。胚胎型是由较长的梭形细胞构成,主要发生于头颈部。目前,RMS主要的治疗手段有非特异性的全身放疗、化疗以及手术切除。近年来关于RMS的研究逐渐增多,但是RMS发生的分子机制尚不明确。近期的研究表明miRNAs参与了横纹肌肉瘤的发生,改变了我们对肿瘤生物学的认识,并且为RMS的早期诊断和特异性治疗提供了潜在的靶点。本实验室前期研究表明miR-214通过下调原癌基因Nras的表达具有促进小鼠C2C12成肌母细胞周期退出和促进骨骼肌分化的作用。在研究中我们发现与正常的骨骼肌组织相比,miR-214在横纹肌肉瘤细胞中呈明显的低表达。因此,我们推测miR-214可能具有抑制横纹肌肉瘤细胞增殖的作用。在横纹肌肉瘤细胞系RD细胞中利用外源性的2’-0-甲基化的oligos瞬时过表达miR-214,通过MTT、细胞计数、Edu插入实验等方法证实过表达miR-214可以明显抑制RD细胞的增殖和DNA的合成。流式细胞技术对RD细胞进行细胞周期分析表明,miR-214可以明显将RD细胞阻滞在G1期。利用Western对转染非特异性对照ns和类似物214mi的RD细胞分析表明,过表达miR-214可以抑制G1期到S期转变的关键性细胞周期蛋白CDK2的蛋白水平,这个结果与流式的结果相互印证。此外,过表达miR-214可以促进RD细胞的凋亡。免疫荧光分析表明,过表达miR-214可以促进RD的骨骼肌分化。生物信息学分析表明,人类的Nras3’-UTR仅有一个miR-214结合位点,但是我们的研究发现miR-214仍然可以负调控人类Nras的蛋白水平。综上所述,miR-214具有抑制横纹肌肉瘤发生的作用。为了进一步研究miR-214的生理功能及病理功能,我们实验室利用基因重组的方法建立了遗传嵌合小鼠miR-214fl/+。将miR-214fl/+小鼠与全身表达Cre重组酶的E2a-Cre小鼠品系交配得到miR-214-/-小鼠。我们观察发现miR-214基因敲除小鼠发育是正常的,可以健康存活到成年期并且具有正常的生育能力。这说明miR-214在发育的过程中并不起着关键性的作用,我们计划探索小鼠成年后在应激或损伤的条件下miR-214的作用是否是必需的。为了研究这种可能性,我们选择了小鼠肌肉损伤模型和心肌肥大模型,在野生型WT和基因敲除miR-214-/-的小鼠中分别建立肌肉损伤模型和心肌肥大模型,分析miR-214在这两种病理过程中的作用。为了在体研究miR-214在横纹肌肉瘤中的作用,我们将miR-214-/-小鼠分别与p53+/-和Ptch+/-小鼠交配以得到miR-214-/-；p53+/-与miR-214-/-；Ptch+/-双敲小鼠。验证miR-214敲除对p53缺失及Ptch缺失引起横纹肌肉瘤的影响。