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研究背景:结直肠癌是发病率和死亡率排名靠前的恶性肿瘤之一,尽管目前的治疗手段和策略取得了巨大的进步,其五年生存率仍然较低。癌细胞发生转移是结直肠癌治疗失败的主要原因,明晰结直肠癌转移的分子调控机制具有重要的临床意义。结直肠癌转移是一个多因素参与多步骤的过程,癌细胞需要突破基底膜的限制进入到血管并在远端定植。上皮间质转化（EMT）指的是上皮细胞在生理或者病理条件刺激下,失去细胞间的紧密连接与粘附连接,增加迁移能力、提高抗凋亡能力,产生大量的胞外基质,同时增加侵袭能力,最终获得间充质细胞表型的生物学过程。目前,EMT被认为是肿瘤转移的起始步骤,促进EMT往往导致肿瘤转移增加。EMT的调控因素众多,其中就包括非编码RNA（ncRNA）。非编码RNA指转录后不编码蛋白质的RNA,主要包括长度在19-22nt的微小RNA（miRNA）和长度大于200nt的长非编码RNA（lncRNA）。miRNA与EMT关系十分紧密,可以通过调控Twist1、Snail1、Zeb1和Zeb2等转录因子的表达来调控EMT。而lncRNA则可以通过碱基互补配对或者折叠等方式形成特定的二级空间结构,从而提供分子结合位点,与DNA、其他RNA以及蛋白质相互作用,共同发挥调控EMT的生物学作用。已证实,H19、ZEB1-AS1、LncRNA-ATB、LncRNA-HIT、MEG3、LncRNA-Hh、MALAT1 和 Hotair 等 lncRNA 均可调控EMT进程。此外,少部分组蛋白去乙酰化酶（HDACs）也被发现参与EMT及肿瘤转移的调控。HDACs是一类催化底物组蛋白的去乙酰化,抑制靶基因表达的酶类。其中HDAC1被发现可与转录因子TCF12相结合促进EMT来促进胆囊癌细胞的侵袭与迁移,SIRT1可与转录因子ZEB1相结合并抑制E-cadherin的表达来促进EMT及胰腺癌细胞转移。然而,HDACs在结直肠癌转移调控中的作用及分子机制目前仍不清楚。研究目的:旨在明确HDACs在结直肠癌转移调控中是否发挥作用,并揭示其发挥作用的具体分子机制。具体如下:（1）筛选出与结直肠癌转移相关的HDAC分子;（2）验证候选出的HDAC2分子对结直肠癌转移的调控作用;（3）筛选并验证HDAC2调控EMT及结直肠癌转移的下游靶分子;（4）明晰HDAC2调控下游靶基因的具体分子机制;（5）明晰下游靶基因调控EMT及结直肠癌转移的具体分子机制;（6）体内动物实验验证HDAC2及下游信号分子对结直肠癌转移的调控作用。研究方法:1.登录肿瘤公共数据库Oncomine,获取HDACs在结直肠癌原发部位与转移灶的表达数据;利用gepia工具分析TCGA数据库中HDACs的表达与结直肠癌患者生存期的关系;通过免疫组化染色检测临床结直肠癌配对样本中HDAC2的表达;通过qPCR和WB检测结直肠癌细胞中HDAC2与E-caherin的表达;通过Starbase数据库分析HDAC2与E-cadherin在直肠癌中表达的相关性。2.敲除结直肠癌细胞DLD1中的HDAC2,基因芯片检测敲除HDAC2之后的基因表达变化,信号通路富集分析与转移相关的信号通路是否发生显著变化;细胞骨架染色检测DLD1敲除HDAC2之后细胞形态的变化;Transwell小室实验及RTCA实验检测敲除和敲低HDAC2之后直肠癌细胞迁移运动能力的改变;WB及免疫荧光染色检测敲除和敲低HDAC2之后直肠癌细胞EMT标记蛋白的表达变化。3.非编码RNA芯片检测敲除HDAC2之后DLD1细胞中ncRNA的表达变化,候选出LncRNA H19作为HDAC2的下游靶基因;qPCR检测敲除和敲低HDAC2之后直肠癌细胞中H19的表达变化;通过siRNA靶向降低DLD1 HDAC2 KO及SW4620细胞中H19的表达,Transwell小室实验及RTCA实验检测干扰H19表达之后直肠癌细胞迁移运动能力的改变;WB检测干扰H19表达之后直肠癌细胞EMT标记蛋白的表达变化。4.通过染色质免疫共沉淀检测HDAC2及组蛋白与H19启动子的结合作用;WB检测敲除HDAC2之后的组蛋白乙酰化水平的改变;荧光素酶报告基因实验和免疫共沉淀实验验证HDAC2与转录因子SP1相互作用对H19启动子活性的的调控;qPCR检测降低CRC细胞中SP1之后H19的表达变化;Transwell小室实验检测干扰SP1表达之后直肠癌细胞迁移运动能力的改变;WB检测干扰SP1表达之后直肠癌细胞EMT标记蛋白的表达变化。5.qPCR检测DLD1细胞中敲除HDAC2之后MMPs的表达变化;WB检测结直肠癌细胞中敲除HDAC2、敲低HDAC2、干扰H19及干扰SP1之后MMP14的表达变化;Transwell小室实验检测干扰MMP14表达之后直肠癌细胞迁移运动能力的改变;WB检测干扰MMP14表达之后直肠癌细胞EMT标记蛋白的表达变化;通过Starbase数据库分析H19与MMP14在直肠癌中表达的相关性以及H19和MMP14 mRNA分别与miR-22-3P的结合位点;通过RIP实验检测H19与miR-22-3P的相互作用;qPCR检测降低CRC细胞中转染miR-22-3P mimics之后 H19 的表达变化;Transwell小室实验检测转染miR-22-3P mimics之后直肠癌细胞迁移运动能力的改变;WB检测转染miR-22-3P mimics之后直肠癌细胞MMP14及EMT标记蛋白的表达变化;6.通过尾静脉向免疫缺陷小鼠体内注射带有Luc标记的直肠癌细胞体内验证HDAC2对直肠癌转移的调控作用;H&E,FISH及免疫组化染色小鼠肺脏组织,验证HDAC2调控直肠癌转移的分子机制。研究结果:1.肿瘤公共数据库资料显示在HDAC1,2,3和8中HDAC2的表达在结直肠癌转移组织中最低,且HDAC2表达越低的结直肠癌患者生存期越短;免疫组化染色显示,在22对临床结直肠癌样本中,有12对样本的转移组织中HDAC2表达下降;qPCR和WB结果显示转移能力强（E-cadherin低表达）的结直肠癌细胞中HDAC2的表达也越低;HDAC2与E-cadherin在结直肠癌中的表达呈正相关。2.基因芯片显示敲除HDAC2之后共有1555条mRNA表达发生了明显变化,信号通路富集分析显示与转移相关的信号通路也发生了显著变化,同时47个与EMT相关的基因表达也明显改变;敲除HDAC2之后的DLD1细胞呈纺锤形,细胞迁移运动能力增加,EMT标记蛋白E-cadherin表达降低,而Fibronectin和ITGA5却显著升高;在另一结直肠癌细胞SW480细胞（HDAC2表达较高,细胞转移能力较低）中敲低HDAC2的表达也出现相同的EMT表型。3.非编码RNA芯片结果显示,LncRNA H19在敲除HDAC2之后上升最为显著。qPCR验证显示,在结直肠癌细胞中敲除或者敲低HDAC2之后H19确实显著上升;通过siRNA靶向降低DLD1 HDAC2 KO细胞中的H19之后,细胞迁移运动能力降低,EMT的标记蛋白E-cadherin表达升高而Fibronectin和ITGA5却显著降低;在另一结直肠癌细胞SW620（H19表达较高,细胞转移能力较强）中敲低H19的表达也出现相似的结果。4.染色质免疫共沉淀实验结果显示,HDAC2可结合到H19的启动子上,WB显示敲除HDAC2之后DLD1细胞中组蛋白H3K27乙酰化水平升高,与此同时H19启动子区域组蛋白H3K27乙酰化水平在敲除HDAC2之后也升高;过表达HDAC2降低H19启动子活性,而干扰HDAC2则与之相反,HDAC2对H19启动子活性的影响在突变掉SP1结合位点后消失;免疫共沉淀结果显示DLD1和SW480细胞中HDAC2均与SP1有较强的相互作用;在结直肠癌细胞中干扰SP1之后,H19的表达上升,细胞迁移运动能力增加,EMT的标记蛋白E-cadherin表达降低,而Fibronectin和ITGA5却显著升高。5.qPCR结果显示,MMP14是敲除HDAC2之后上升最为显著的MMP分子;WB显示结直肠癌细胞中敲除HDAC2、敲低HDAC2、及干扰SP1之后MMP14表达上升,而干扰H19之后MMP14确下降;使用siRNA靶向降低结直肠癌细胞中的MMP14之后,细胞迁移运动能力降低,EMT的标记蛋白E-cadherin表达升高,而Fibronectin和ITGA5却显著降低;H19与MMP14在结直肠癌中的表达呈正相关;预测显示H19及MMP14 mRNA与miR-22-3p均有两处结合位点;RIP实验证实H19确实可与miR-22-3p结合;在直肠癌细胞中转染miR-22-3p mimics之后,H19的表达水平没有变化,细胞迁移运动能力降低,MMP14表达降低,EMT的标记蛋白E-cadherin表达升高,而Fibronectin和ITGA5却显著降低。6.尾静脉注射构建结直肠癌肺转移模型显示,敲除HDAC2之后直肠癌肺转移能力显著增加,而这种增加在干扰H19之后显著降低;小鼠肺脏组织免疫组化染色显示敲除HDAC2之后E-cadherin表达降低而MMP14升高,在干扰H19之后E-cadherin和MMP14的变化有所降低;与SW480细胞相比,SW620细胞的肺转移能力更强,免疫组化染色显示SW620形成的肺部转移灶中HDAC2及E-cadherin的表达更低,而MMP14的表达却更高。研究结论:1.HDAC2在结直肠癌转移组织中低表达且与结直肠癌患者生存期密切相关,低表达HDAC2促进EMT及结直肠癌转移;2.LncRNA H19是HDAC2负向调控结直肠癌EMT与转移的下游靶基因;3.HDAC2通过与转录因子SP1结合,“锚定”到H19启动子区域,催化组蛋白H3K27去乙酰化来抑制H19的表达;4.H19通过吸附miR-22-3p,解除其对MMP14的抑制作用,上调MMP14的表达来促进EMT及结直肠癌转移。