背景与目的:脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种非常常见和严重的疾病,其患病率约为120/100000,58%的患者在一年内死亡。三分之二的幸存者将面临中度甚至重度残疾。脑出血的高发病率和高死亡率是由占位效应所致原发性损伤和血红蛋白降解产物诱导的继发性损伤共同造成的。目前缺乏基于循证医学证据的外科手术策略,促使研究人员寻找治疗ICH后继发性损伤的可能干预靶点及手段。脑出血后继发性脑损伤包括神经元死亡、ROS爆发和DNA损伤。动物模型和人体样本的证据表明,脑出血后神经元死亡的主要类型是坏死并伴随着严重的炎症、水肿和组织损伤。细胞坏死既往被认为是一种伴随炎症和组织损伤的非程序性细胞死亡。但是,随着2005年首次报道部分细胞坏死过程可以被调控,不同类型的调节性细胞坏死相继被发现,其中多种类型的细胞坏死与中枢神经系统疾病相关。调节性坏死通过促进炎症和组织损伤在中枢神经系统疾病的发展中起着极其重要的作用,甚至被认为是成熟中枢神经系统细胞死亡的主要执行者。动物模型和人类样本的证据表明脑出血后神经元死亡的主要类型是坏死。一些证据表明,铁可以直接引发导致神经元死亡,而其他研究表明铁的积累只是神经元死亡的诱发因素。总的来说,铁超载及其对神经元死亡的影响尚不完全清楚。游离铁离子可引起不同类型细胞的脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。已有的研究发现,脑出血后患者和实验动物脑组织出现急性和严重的铁超载,铁超载与继发性脑损伤密切相关。动物研究表明,清除过量的铁可以改善脑出血的预后。目前,针对脑出血后铁超载引起损伤的治疗主要集中在铁螯合剂和抗氧化剂。然而,最近的临床研究结果显示铁螯合剂或抗氧化剂治疗没有显著改善ICH患者脑出血的预后。铁离子参与细胞的许多正常生理功能,包括细胞色素氧化酶等某些酶的活性维持、中枢系统中的突触形成等生理过程。活性氧也参了机体正常的生理功能,如NOX（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[NADPH]）氧化酶参与的吞噬功能和一些细胞内信号传导。因此,铁螯合和ROS清除的一个挑战是在尽量少影响铁和ROS依赖性的生理功能情况下,减轻病理性铁和ROS过量积累引起的脑损伤。可见,目前迫切需要寻找特异且精准的铁超载相关神经细胞损伤靶点,以利于通过干预来减轻继发性神经损伤。在本研究中,我们围绕以下三个方面进行研究:1、我们首先用小鼠自体血ICH模型确定脑出血后血肿周围脑组织铁离子价态,再利用体外铁超载模型及RNA-sequencing寻找铁离子引起的神经细胞损伤靶点与主要损伤特征;2、确定脑出血后铁超载引起神经元损伤的具体分子机制;3、针对我们所确定的机制,探讨对实验性小鼠脑出血的治疗作用。第一部分:线粒体功能障碍是脑出血后神经元铁超载的主要损伤特征目的:发现并确认脑出血后铁超载导致的主要损伤靶点方法:为验证脑出血（ICH）后血肿周围的铁离子的价态,提取脑出血后血肿周围与皮层脑组织,采用一种新的铁离子检测方法分别测定Fe2+和Fe3+。从不同铁离子剂量处理的PC-12细胞中提取RNA,并对其进行序列测定,探讨铁离子诱导神经元损伤的机制。其次,根据测序筛选结果应用线粒体功能检测试剂研究亚铁离子对线粒体复合体Ⅰ功能的影响,用能量代谢检测仪与ATP检测分析铁超载对氧耗率（OCR）和三磷酸腺苷（ATP）的影响。结果:（1）脑出血后24小时,二价铁（而非三价铁）浓度急剧升高,脑出血后28天皮层和内囊中的铁离子浓度仍显著高于正常浓度。（2）用50或250μM FeCl2处理PC-12细胞后,RNA测序检测到差异表达基因。与未处理的PC-12细胞相比,50μM FeCl2处理的细胞有110个基因的表达发生了显著变化,而250μM FeCl2处理的细胞有129个基因的表达发生了显著变化。此外,50和250μM FeCl2处理后细胞的线粒体相关基因占差异表达基因的比例分别为42%和19%。对线粒体相关基因的进一步分析显示,50μM和250μM FeCl2处理后细胞的线粒体呼吸复合物I相关基因的表达发生了显著变化。（3）Fe2+以剂量依赖的方式降低细胞的氧耗率（OCR）和三磷酸腺苷（ATP）水平,且铁超载显著降低了线粒体NAD+/NADH比值。利用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）及活细胞工作站实时检测PC-12细胞线粒体膜电位（ΔΨm）发现,250μM亚铁处理PC-12细胞12h后TMRM的荧光强度降低。结论:线粒体功能障碍是神经元亚铁超载的重要生物标志物,以NAD+/NADH比值下降、OCR与ATP含量降低、线粒体膜电位去极化为其主要特点。第二部分:线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路介导的线粒体去极化促进脑出血后神经元坏死目的:确认线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路及其在脑出血后线粒体去极化依赖的神经元死亡中的作用方法:利用活细胞二价铁离子探针RPA（罗丹明B-[（1,10-菲咯啉-5-基）氨基羰基]苄基酯）检测线粒体游离Fe2+,免疫共沉淀检测线粒体分子CypD乙酰化水平,钙黄绿素释放试验原位评价mPTP开放,CRISPR-Cas9技术构建CypD敲除的细胞（CypD-KO-PC-12细胞系）,RNAi方法敲低PC-12细胞的ABCB10。结果:（1）线粒体亚铁超载导致神经元线粒体膜电位降低。（2）线粒体亚铁超载导致CypD乙酰化增加,使神经元mPTP开放。（3）开放的mPTP增加（促进）神经元线粒体Fe2+超载。（4）CypD乙酰化抑制剂或CypD缺失可抑制铁超载引起的线粒体功能障碍和膜电位去极化引起的神经元死亡。结论:Fe2+超载可降低线粒体膜电位、增加CypD的乙酰化。CypD乙酰化的增加促使神经元细胞mPTP开放,进而促进亚铁(线粒体Fe2+内流)通过开放的mPTP进入线粒体基质,加速神经元死亡;而抑制CypD乙酰化或CypD缺失则可抑制Fe2+超载引起的线粒体功能障碍和神经元死亡。即,线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路介导的线粒体去极化促进了脑出血后神经元坏死。第三部分:脑出血后抑制线粒体去极化的神经保护作用目的:探讨抑制线粒体去极化对脑出血后神经系统的保护作用方法:PI染色检测亚铁与兴奋性氨基酸情况下的原代神经元死亡。小鼠脑出血模型下,应用BMS、pole test和旷场实验评价小鼠脑出血后的神经功能。结果:（1）兴奋性氨基酸加重了Fe2+超载引起的神经元坏死。（2）环孢素A治疗或CypD缺失可在体内外抑制脑出血后的神经元坏死,改善神经功能。（3）线粒体活性氧清除剂MitoQ减轻脑出血导致的白质损伤,改善神经功能。结论:线粒体Fe2+内流/CypD乙酰化正反馈分子环路是ICH的治疗靶点,CsA与MitoQ处理或CypD缺失能明显抑制脑出血后急性期和慢性期的神经功能缺损。