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研究背景:祖卡木颗粒是《国家基本药物目录(2018版)》、《国家急(抢)救药品直接挂网采购示范药品目录》收载的维药重点品种,是非常具代表性维成药之一。作为维医药理论中治疗感冒的首选药物,具有独特的抗炎及止咳药效,临床研究表明其疗效确切,安全可靠,但目前应用科学方法阐释其组方抗炎机制的实验设计相对不足。本研究在国家自然科学基金(81860803)资助下,融合中医学语言进行功能表述与组方药物分类,借鉴现代医学生物指标表征作用靶点,将有利于提高祖卡木颗粒的理论价值和临床价值。目的:依据网络药理学预测得到的祖卡木颗粒抗炎活性的潜在作用靶点与机制,观察祖卡木颗粒及其组方中不同功效药物组合对AM细胞吞噬强度、细胞数量、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子-κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)信号通路以及细胞凋亡的差异性影响,分析并验证祖卡木颗粒组方中不同功效药物组合抗炎机制的差异性。方法:(1)祖卡木颗粒抗炎活性潜在作用机制预测:①利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)与各大期刊网站开源数据库,检索并筛选祖卡木颗粒潜在的有效化学成分,依托TCMSP、Stitch等平台筛选并预测上述有效化学成分的潜在作用靶点,构建祖卡木颗粒“有效活性成分-潜在作用靶点”数据集;②利用Genecards数据库检索炎症相关潜在作用靶点,汇总与祖卡木颗粒的共有靶点导入String数据库中,构建祖卡木颗粒“潜在作用靶点-炎症”蛋白质相互作用网络图并进行通路分析与功能富集分析,预测祖卡木颗粒抗炎活性的潜在作用靶点与机制;③基于上述实验结果,进一步分析祖卡木颗粒组方中疏散风热、止咳化痰、益胃润肺3组不同功效药物组合抗炎作用机制的差异性。(2)祖卡木颗粒抗炎活性与作用靶点验证:以博莱霉素所致大鼠肺纤维化为病理模型,以AM吞噬作用为切入点,研究祖卡木颗粒IPF大鼠不同时间节点的干预作用。①机体病理状态方面,考察祖卡木颗粒对大鼠体重、体温、呼吸频率、肺组织病理情况及羟脯氨酸含量的差异性影响,验证其抗炎活性;②药效作用靶点方面,以祖卡木颗粒对AM吞噬强度的影响为切入点,研究AM细胞数量、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及细胞凋亡、自噬程序的平衡关系对其的干预情况,在一定程度上验证预测得到的祖卡木颗粒抗炎活性作用靶点与相关通路机制;③分析并验证祖卡木颗粒组方中疏散风热、止咳化痰、益胃润肺3组不同功效药物组合对IPF作用的差异性。结果:(1)祖卡木颗粒抗炎活性潜在作用机制预测:①结合数据库筛选与文献资源补充,剔除多味药物共有成分后得到祖卡木颗粒有效活性成分165个;综合利用TCMSP、Stitch等网络药理学平台,剔除多类活性成分共有靶点后得到祖卡木颗粒潜在作用靶点235个;②利用Genecards数据库检索炎症相关潜在作用靶点695个,与祖卡木颗粒的共有潜在作用靶点为89个;使用String数据库对共有靶点进行“潜在作用靶点-炎症”蛋白质相互作用分析、通路分析与功能富集分析,初步证实祖卡木颗粒抗炎活性的作用机制可能与Toll样受体信号通路及细胞增殖相关,并涉及细胞吞噬、细胞凋亡、细胞自噬等细胞程序,为后续生物学效应验证试验的指标选择奠定基础;③祖卡木颗粒组方中3组不同功效药物组合的抗炎机制比较分析结果显示,疏散风热组药物的抗炎作用与低氧诱导因子-1(hypoxiainducible factor-1,HIF-1)信号通路可能相关,益胃润肺组药物的抗炎作用可能与Toll样受体信号通路相关,且3组药物多数抗炎信号通路下游可能与细胞凋亡相关联。(2)祖卡木颗粒抗炎活性与作用靶点验证:①抗炎活性验证试验表明,在给药第3天时,表里双治组大鼠体温显著降低(P<0.01),疏散风热组大鼠呼吸频率显著降低(P<0.01),2组大鼠肺组织羟脯氨酸含量与模型组相比有统计学差异(P<0.05);在给药第14天时,祖卡木组肺组织羟脯氨酸含量显著降低(P<0.01);在给药第28天时,表里双治组大鼠体重与模型组相比具有显著性差异(P<0.01),益胃润肺组羟脯氨酸含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。肺组织病理切片HE染色结果同样表明祖卡木颗粒复方及其不同药物组合均可在一定程度上起到控制炎症浸润与纤维化进展的治疗作用。②抗炎作用靶点验证实验表明,对于AM细胞吞噬强度,给药第3天时,祖卡木组与其所含不同药物组合均较模型组有显著提高(P<0.01);给药14天时,5组受试药物组较模型组提高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。对于AM细胞数量,在给药第3天时,表里双治组与模型组相比具有统计学差异(P<0.05),疏散风热组、止咳化痰组与益胃润肺组AM细胞数目显著低于模型组(P<0.01);给药第14、28天时,5组受试药物大鼠AM细胞相对数目均低于模型组(P<0.05)。对于TLR4/MyD88/NF-κB表面受体信号通路,给药第3、7天时,5组受试药物组TLR4、MyD88 mRNA表达量较模型组显著降低(P<0.01);给药第3天时,祖卡木组、止咳化痰组与益胃润肺组NF-κB mRNA表达量较模型组降低(P<0.05),给药第7天时,祖卡木组、疏散风热组、益胃润肺组与表里双治组的表达量较模型组低(P<0.05)。对于细胞凋亡、自噬程序的平衡关系,结果显示祖卡木颗粒及其不同药物组合均能显著降低肺泡巨噬细胞的凋亡率(P<0.01),其作用机制可能与干预关联蛋白B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)与自噬蛋白Beclin1结合、抑制凋亡蛋白Caspase3的激活相关;③深入对比分析祖卡木颗粒组方中不同功效药物组合对IPF作用的差异性,结果显示疏散风热组药物对于细胞凋亡及其与细胞自噬的平衡关系调节作用较为显著(P<0.01),益胃润肺组药物对于Toll样受体信号通路的调节作用较为突出(P<0.05),同时三组药物均可以对AM细胞的吞噬与增殖、促炎因子的转录与分泌起到较好的调节作用,与网络药理学预测结果相符。结论:整合传统与现代的多学科研究方法,可成功预测并验证祖卡木颗粒及其组方中不同功效药物组合的抗炎活性潜在作用机制。同时,以AM的吞噬强度为线索,可实现对AM细胞数量、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路及细胞凋亡、自噬程序的平衡关系等祖卡木颗粒相关抗炎活性机制的研究与探讨。疏散风热组药物对于细胞凋亡及其与细胞自噬的平衡关系调节作用较为突出,益胃润肺组药物对于Toll样受体信号通路的调节作用较为显著,提示不同功效药物组合可能存在不同的抗炎机制与靶点,还需进一步深入探讨。