论文部分内容阅读
研究目的:本课题组利用化学缺氧模拟剂氯化钴（cobalt chloride,Co Cl2）处理诱导多种类型肿瘤细胞,在体外成功分离纯化出一种特殊的肿瘤干细胞（cancer stem cells,CSCs）亚群——多倍体肿瘤巨细胞（polyploid giant cancer cells,PGCCs）。PGCCs体积是正常二倍体细胞的3倍以上,呈现多核或巨核,并通过出芽等方式产生具有高侵袭迁移能力的子代细胞。其具备肿瘤干细胞的所有特征,是肿瘤异质性的关键。前期研究证实,PGCCs存在G2/M期阻滞现象,其形成与细胞周期蛋白的异常表达和亚细胞定位的改变密切相关,被认为是进行了错误的有丝分裂和基因组不稳定的产物,但具体分子机制仍需进一步探究。本次研究我们通过检测人卵巢癌细胞系HEY和乳腺癌细胞系BT-549中CDC25C、CHK1、CHK2、PLK1、Aurora A、P53、cyclin B1、CDK1和p38MAPK、ERK、JNK等细胞周期蛋白在氯化钴处理前后的蛋白表达水平及亚细胞定位情况,结合人体卵巢癌和乳腺癌肿瘤组织芯片分析,探究CDC25C及其相关细胞周期蛋白调控PGCCs形成的分子机制其临床病理意义。方法:（1）通过蛋白质免疫印迹及免疫细胞化学技术检测氯化钴处理前后CDC25C、cyclin B1、CDK1、CHK1、CHK2、Aurora A、P53、p38MAPK、ERK、JNK以及p CDC25C-Ser198、p CDC25C-Ser216的表达水平及亚细胞定位情况;（2）通过小分子si RNA干扰技术抑制对照组和氯化钴处理组细胞中CDC25C和P53的表达,通过蛋白质免疫印迹及免疫细胞化学技术检测CDC25C和P53抑制前后相关细胞周期蛋白的表达情况;H&E染色统计CDC25C抑制前后对照组和处理组细胞中PGCCs的数量;利用平板克隆形成实验、划痕实验、迁移和侵袭实验等功能实验检测CDC25C抑制前后两组细胞的增殖、迁移和侵袭能力变化情况;（3）免疫共沉淀结合质谱技术检测p CDC25C-Ser216、p CDC25C-Ser198相互作用的蛋白质及生物学特性;（4）使用MG-132蛋白酶抑制剂抑制泛素依赖性蛋白酶体降解途径以探寻细胞周期相关蛋白降解途径;（5）细胞周期检测:氯化钴、si RNA-CDC25C及MG-132处理对细胞周期的影响;体外激酶活性实验检测氯化钴处理前后细胞激酶活性差异;（6）免疫组织化学检测人体肿瘤组织芯片:收集81例卵巢癌和229例乳腺癌石蜡包埋组织制成组织芯片,通过免疫组织化学技术检测CDC25C、CDK1、PLK1、Aurora A、CHK1、CHK2、p38MAPK、ERK、JNK在两种肿瘤组织不同组别的表达水平并分析其临床病理意义。结果:（1）经氯化钴处理人卵巢癌细胞HEY和乳腺癌细胞BT-549可诱导形成PGCCs及其子代细胞;PGCCs及其子代细胞低表达CDC25C、cyclin B1、CDK1和CHK1,高表达PLK1、Aurora A、CHK2、P53、p38MAPK、JNK;CDC25C、cyclin B1、CDK1、PLK1、Aurora A、CHK2、p38MAPK在对照组细胞中胞浆胞核均有表达,但在PGCCs仅在胞浆表达;CHK1、ERK、JNK、p CDC25C-Ser216在氯化钴处理前后的对照组细胞和PGCCs及其子代细胞中均只在胞浆表达;P53和p CDC25C-Ser198仅定位于胞核中;抑制CDC25C可诱导PGCCs的形成。（2）对照组中抑制CDC25C表达后检测到cyclin B1、CDK1、PLK1、Aurora A、CHK1、CHK2、p38MAPK、ERK和JNK表达下调;PGCCs及其子代细胞在抑制CDC25C后,cyclin B1、CDK1、PLK1、Aurora A、p38MAPK、ERK和JNK表达下调,CHK1和CHK2表达上调;CDC25C抑制组细胞较转染阴性对照组细胞中PGCCs数目增加,差异具有统计学意义;功能试验结果显示抑制CDC25C表达细胞侵袭、迁移和增殖能力均低于转染阴性对照组细胞。（3）免疫共沉淀结合质谱分析结果表明,P53通过调控CDC25C-Ser216和CDC25C-Ser198位点的磷酸化调控CDC25C;p38MAPK、ERK通过调控CDC25C-Ser216位点的磷酸化调控CDC25C。（4）PGCCs中细胞周期相关蛋白存在泛素依赖性蛋白酶体降解途径被及时降解。（5）氯化钴、si RNA-CDC25C及MG-132处理后有更多细胞处于G2/M期,存在G2/M期阻滞;氯化钴处理后的PGCCs及其子代细胞激酶活性较对照组升高。（6）CDC25C、CDK1、PLK1、Aurora A、CHK1、CHK2、p38MAPK、ERK和JNK在人卵巢癌肿瘤组织和乳腺癌肿瘤组织的淋巴转移灶中的表达强度均高于相应的原发灶,差异具有统计学意义。结论:PGCCs的形成与细胞周期相关蛋白的异常表达和亚细胞定位的改变密切相关;CHK1/CHK2-CDC25C（p CDC25C-Ser216）-cyclin B1-CDK1和Aurora A-PLK1-CDC25C（p CDC25C-Ser198）-cyclin B1-CDK、p38MAPK-ERK-JNK-CDC25C信号通路通过调控细胞G2/M期转换参与PGCCs的形成;P53可直接调控CDC25C-Ser216和CDC25C-Ser198的磷酸化,不同表型的p53通过调控CDC25C相应的磷酸化位点和亚细胞定位参与调控PGCCs的形成;抑制CDC25C可诱导PGCCs的形成;抑制CDC25C抑制HEY和BT-549肿瘤细胞侵袭、迁移和增殖能力;细胞周期相关蛋白在人体卵巢癌和乳腺癌组织中淋巴转移灶中高表达提示细胞周期相关蛋白的表达与肿瘤的恶性程度和是否发生转移密切相关。