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粒系集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF)在调节髓细胞增生、分化、生存中起着非常重要的作用,可以动员骨髓干细胞由骨髓释放入外周血。基于这一机制,Orlic提出了细胞因子动员骨髓干细胞归巢至缺血损伤部位修复梗死心脏的设想1,随后在成鼠心肌梗死前后注射重组人G-CSF等细胞因子治疗,治疗组心功能和生存率均有明显改善2-8。其后的基础研究结果证明,除了可以动员骨髓干细胞以外,由于心肌细胞表面有G-CSF受体表达,G-CSF还可以通过活化心肌细胞的G-CSF受体直接作用于心肌细胞本身,激活相关的蛋白激酶Jak2-STAT3和Akt-eNOS信号转导途径,从而抑制心肌细胞凋亡,这说明了G-CSF对心肌细胞具有直接保护作用即抗凋亡效应7-8。
目前对于G-CSF的研究多集中于心肌梗死后梗死心肌的再生和保护方面,而G-CSF对于非梗死心肌的作用如何?对于冠心病常常伴有的高血压、心力衰竭中的心肌细胞是否有益?其作用的机制到底怎样?已经有研究证明G-CSF干预可以改善心肌梗死后小鼠的心功能,但与心肌再生无明显相关。同样,在最近的动物实验中我们发现G-CSF在压力超负荷所至的心肌肥厚模型中能够加重心肌肥厚的形成,提示了G-CSF可能对心肌细胞还有抗凋亡以外的作用。
心力衰竭是各种心血管疾病包括高血压、冠心病等的终末阶段。心力衰竭不仅仅是心肌细胞和血管完整性的病理变化同时也是一系列神经体液因素的激活参与的过程,其中交感神经和肾素血管紧张素系统最为重要。无论是心力衰竭还是高血压都伴随心肌细胞代偿性的增大,造成心肌肥厚,心室重构。左室心肌肥厚是引起心血管疾病发生率与死亡率升高的因素之一。研究发现,丝裂素活化蛋白激酶家族(Mitogenactivatedproteinkinases,MAPKs)参与心肌细胞的增殖,分化和凋亡过程,其中研究重点在ERK通路,ERK是把细胞外信号转导到核内调控基因表达的重要细胞内信号分子,是不同促增殖因子调控的共同通路。
由此,我们设计了验证G-CSF是否能够直接促进心肌细胞肥大的细胞水平的实验,观察了G-CSF刺激下心肌细胞的肥大反应,我们选择了与细胞增生相关的ERK磷酸化作为评价指标;同时,由于心肌细胞内的血管紧张素系统参与了心肌细胞肥大的形成过程,我们又以细胞内血管紧张素原(AGT)和血管紧张素受体作为切入点,分别选用了血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)进行干预,着重研究了G-CSF在细胞水平促进心肌细胞肥大的可能机制。
第一部分G-CSF促进压力超负荷引起的心肌肥厚作用
目的:观察G-CSF对压力超负荷心肌肥厚动物模型心肌肥厚形成的影响
方法:选10周龄雄性C57/BL6小鼠,通过缩窄升主动脉建立压力超负荷模型。造模成功后平均分成4组(每组6只),分别为生理盐水组(每天1次皮下注射生理盐水到实验结束)、G-CSF组(每天1次皮下注射G-CSF<5μg/kg/d>,连续注射5天后改为每天1次皮下注射生理盐水到实验结束)、ARB+G-CSF组(每天1次皮下注射ARB<10-7M>到实验结束;同时每天1次皮下注射G-CSF<5μg/kg/d>连续5天)、ARB组(每天1次皮下注射ARB<10-7M>到实验结束)。另外设伪手术组作为对照。2W后做心脏超声检查,测量左室厚度,并测右颈动脉血压。
结果:1)压力超负荷2周后,生理盐水组与对照组比较,左室厚度明显增加(P＜0.05);G-CSF皮下注射组与生理盐水组比较,左室厚度进一步增加(P＜0.05),提示G-CSF加重压力超负荷引起的心肌肥厚;
2)压力超负荷后ARB组与生理盐水组比较,2周后左室厚度明显减低(P＜0.05),ARB+G-CSF组与G-CSF组比较,2周后左室厚度也明显减低(P＜0.05),提示ARB不但能减轻压力超负荷引起的心肌肥厚,也能部分抑制G-CSF导致的心肌肥厚。
结论:G-CSF能够加重压力超负荷引起的心肌肥厚,其机制可能与激活血管紧张素有关。
第二部分G-CSF引起心肌细胞肥大反应的机制研究
目的:研究离体状态下G-CSF诱导的心肌细胞肥大反应以及相关的机制。
方法:
1)细胞免疫荧光:SD乳鼠原代心肌细胞经10％FBS的DMEM培养液培养24h后更换为0.2％FBS的DMEM培养液继续培养48h。实验设2个大组:对照组和G-CSF干预组,分别加生理盐水和G-CSF(终浓度为100ng/ml)培养48h。细胞固定后孵育两种抗体:抗Actinin和抗ERK抗体;分别用FITC和Rhodamine荧光抗体标记后荧光显微镜拍照。观察心肌细胞肥大反应。实验重复3次。
2)Westernblot法检测ERK活性:SD乳鼠原代心肌细胞经10％FBS的OMEM培养液静置培养24小时后更换低血清(0.2％)DMEM继续培养24h,加入干预因素,首先观察G-CSF作用的时间曲线,实验分5组:A.0min组B.5min组C.10min组D.15min组E.30min组。其次加入ARB和ACEI前处理后再加G-CSF,实验分4组:A.空白对照组。B.G-CSF组。C.ARB+G-CSF组D.ACEI+G-CSF组。G-CSF终浓度为100ng/ml。用westernblot法测定磷酸化ERK表达。实验重复3次。
3)RT-PCR法检测AGT表达:SD乳鼠原代心肌细胞经10％FBS的DMEM培养液培养24h后,更换为低血清(0.2％)DMEM培养基继续培养24小时.实验设4组,按照G-CSF作用时间不同分为:对照组,2h组,6h组,12h组。每组分别加入G-CSF使G-CSF终浓度为100ng/ml。以RT-PCR方法检测AGT水平变化。实验重复3次。
结果:1)G-CSF作用心肌细胞后能够导致心肌细胞肥大,并引起ERK向细胞核周围聚集。
2)G-CSF引起心肌细胞内磷酸化ERK表达增多,呈时间依赖性,30min达到最高。
3)ACEI部分降低G-CSF对ERK的磷酸化水平(P＜0.05),ARB对心肌细胞磷酸化ERK蛋白的表达有降低趋势但无统计学意义。
4)G-CSF作用心肌细胞2h后,AGT水平较对照组有明显升高。(P＜0.05);G-CSF作用6h后AGT仍然处于较高水平(P＜0.05),12h回落到对照组水平.
结论:G-CSF能够引起离体心肌细胞肥大反应。其机理与激活ERK信号通路和血管紧张素系统相关。