【摘 要】
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目的通过人成纤维细胞与人乳腺癌细胞及人乳腺正常上皮细胞进行共培养,模拟“种子”与“土壤”的肿瘤微环境,观察间质中主要成分成纤维细胞对肿瘤及上皮细胞生长与分化的影响,分析成纤维细胞生理生化的改变与乳腺癌发生发展和预后的关系,探讨成纤维细胞相关生理生化改变作为肿瘤筛查、诊断及预后的生物标志物达到将肿瘤预防哨点监测的“关口”前移的可行性。方法（1）将人成纤维细胞（CCC-ESF-1）与乳腺癌细胞株（MD
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目的通过人成纤维细胞与人乳腺癌细胞及人乳腺正常上皮细胞进行共培养,模拟“种子”与“土壤”的肿瘤微环境,观察间质中主要成分成纤维细胞对肿瘤及上皮细胞生长与分化的影响,分析成纤维细胞生理生化的改变与乳腺癌发生发展和预后的关系,探讨成纤维细胞相关生理生化改变作为肿瘤筛查、诊断及预后的生物标志物达到将肿瘤预防哨点监测的“关口”前移的可行性。方法（1）将人成纤维细胞（CCC-ESF-1）与乳腺癌细胞株（MDA-MB-231,MDA-MB-468）及人乳腺正常上皮细胞（MCF10A）采用条件培养基法进行共培养:a.当细胞生长汇合至大约80%时,弃去原有培养基,更换无血清培养基培养24h,离心后收集上清液分装制成含5%胎牛血清（Fetal bovine serum,FBS）的条件培养基（Conditioned Medium,CM）;b.按照此方法分别制成了CCC-ESF-1-CM、MDA-MB-231-CM、MDA-MB-468-CM、MCF10A-CM,即以成纤维细胞和乳腺正常细胞、癌细胞互相作为彼此的目的细胞与条件细胞;c.观察比较细胞条件培养基共培养前后的生长状况,采用实时荧光定量PCR检测成纤维细胞和乳腺正常细胞、癌细胞中EGFR m RNA的变化;Western Blot检测EGFR、Vimentin、E-cadherin蛋白的表达变化,免疫细胞化学法检测乳腺正常细胞、癌细胞中EGFR表达变化;（2）人乳腺癌组织芯片EGFR免疫组织化学染色,比较不同成纤维细胞间质含量的组织中乳腺正常细胞、癌细胞EGFR表达情况,分析成纤维细胞对乳腺上皮细胞生长分化的影响。结果1.与MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF10A条件培养基共培养的CCC-ESF-1细胞中,EGFR m RNA与EGFR蛋白水平变化相比于单独培养表达均上调,分别增加30.75%（P<0.05）、7.20倍（P<0.05）和35.24倍（P<0.05）;Vimentin表达均下调,分别降低8.88%（P<0.05）、17.94%（P<0.05）和11.19%（P<0.05）;E-cadherin表达上调分别增加2.61倍（P<0.05）、14.72倍（P<0.05）和1.56倍（P<0.05）。2.与CCC-ESF1条件培养基共培养后,MDA-MB-231,MCF10A细胞EGFR m RNA和蛋白表达水平均下调,相比于单独培养,分别降低98.83%（P<0.05）和59.98%（P<0.05）;MDA-MB-468细胞EGFR m RNA和蛋白水平表达均上调,蛋白表达增加4.79倍（P<0.05）;MDA-MB-231,MCF10A细胞Vimentin表达上调,分别增加32.54%（P<0.05）和30.51%（P<0.05）;MDA-MB-468细胞Vimentin表达下调62.43%（P<0.05）。MDA-MB-231细胞几乎不表达E-cadherin,且与单独培养相比差异不具有显著性（下降13.42%,P>0.05）;MDA-MB-468、MCF10A细胞E-cadherin表达均上调,分别增加2.40倍（P<0.05）和15.33%（P<0.05）。3.人乳腺癌组织芯片分析检测,远癌（正常）组织中间质含量越高,乳腺上皮细胞EGFR表达越强;在癌组织中,间质含量过高或过低,乳腺肿瘤细胞EGFR均不表达。结论1.乳腺上皮细胞可以上调成纤维细胞EGFR和E-cadherin的表达水平,并且降低Vimentin表达水平,说明在肿瘤微环境中正常成纤维细胞可能逐渐发生间充质-上皮转化。2.成纤维细胞可使MDA-MB-231和MCF10A中EGFR表达降低,MDA-MB-468中EGFR表达增加,而Vimentin的表达趋势则与之相反。成纤维细胞对不同的乳腺癌细胞及正常上皮细胞调控机制可能存在差异性。MDA-MB-468和MCF10A细胞中E-cadherin表达均上调,说明成纤维细胞可能促进乳腺细胞间的黏附,降低分化程度。3.人乳腺癌组织芯片表明间质中成纤维细胞可下调乳腺癌细胞EGFR表达,与细胞实验结果一致,成纤维细胞能够调控乳腺上皮细胞的生长分化。4.成纤维细胞作为重要的细胞间质成分,和乳腺上皮细胞存在“土壤”与“种子”的关系,对乳腺上皮细胞的生长与分化起着重要调控作用,与乳腺癌发生发展和预后密切相关。成纤维细胞相关生理生化改变一般早于上皮细胞,可作为肿瘤筛查、诊断及预后的生物标志物,将肿瘤预防哨点监测“关口”前移具有可行性。
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