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细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）是几乎所有细胞均可释放的纳米级被膜囊泡,在细胞间通讯中发挥着重要作用。卵泡液中含有EVs,对卵泡发育以及卵母细胞成熟具有调控功能。到目前为止,关于卵泡液EVs的研究基本都集中在小细胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）上。由于sEVs是一个混合的异质性群体,不同胞内来源的sEVs亚型可能具有不同的功能和临床应用,因此卵泡液不同sEVs亚型的异质性成了EVs研究领域亟待解决的主要问题之一。本研究采用差速超速离心结合碘克沙醇密度梯度浮选的方法从牛小卵泡（3-5 mm）的卵泡液中分离出两种sEVs亚型,即低密度的sEVs（sEVs-F6）和高密度的sEVs（sEVs-F8）。本研究进行了两种sEVs亚型的分离鉴定,并通过卵巢颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取特性进行了研究,比较分析了两种sEVs亚型miRNA表达谱,研究了两种sEVs亚型对卵巢颗粒细胞增殖凋亡的影响。研究结果如下:（1）牛卵泡液sEVs亚型的分离鉴定。首先,使用差速超速离心法分离牛卵泡液中的EVs,获得大细胞外囊泡（large extracellular vesicles,l EVs）和sEVs,检测两种EVs种群标志蛋白质的表达、囊泡形态及粒径分布情况。结果表明,四次跨膜蛋白（CD63）和肿瘤易感基因101蛋白（tumor susceptibility gene 101,TSG101）在sEVs中显著富集,葡萄糖调节蛋白94（glucose regulatory protein 94,GRP94/GP96）在l EVs中显著富集;两种EVs均具有典型的杯状结构;sEVs的囊泡尺寸更小。之后,使用碘克沙醇密度梯度浮选法分离牛卵泡液中的sEVs亚群,获得低密度的sEVs（sEVs-F6）及高密度的sEVs（sEVs-F8）,检测两种sEVs亚型标志蛋白质的表达、囊泡形态、粒径分布、RNA含量、囊泡数量及蛋白含量。结果表明,CD63在sEVs-F8中显著富集,TSG101在sEVs-F6中显著富集;两种sEVs均具有典型的杯状结构;sEVs-F6中的囊泡尺寸更小;sEVs-F8中的RNA含量显著高于sEVs-F6,但囊泡数量显著低于sEVs-F6;两种sEVs蛋白含量基本一致。（2）卵泡颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取特性的研究。首先,使用PKH67对分离到的两种sEVs亚型进行荧光标记,通过共聚焦显微镜和流式细胞术观察颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取情况,采用添加特异性抑制剂及si RNA干扰的方法探究颗粒细胞摄取两种sEVs亚型的具体机制。结果表明,颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取呈时间依赖性,颗粒细胞对sEVs-F8的摄取率更高;颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取在4℃时几乎被完全抑制;加入过量未标记EVs组的颗粒细胞中的荧光强度显著降低;添加肝素、MβCD或EIPA可以显著抑制颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取;添加genistein或wortmannin只可显著抑制颗粒细胞对sEVs-F8的摄取;下调小窝蛋白-1（caveolin-1,CAV-1）抑制颗粒细胞对两种sEVs亚型的摄取;下调脂筏特征蛋白1（Flotillin-1,FLOT1）或P21活化激酶1（P21（RAC1）Activated Kinase 1,PAK1）只可显著抑制颗粒细胞对sEVs-F8的摄取。（3）牛卵泡液不同sEVs亚型miRNA表达谱的分析和验证。对两种sEVs亚型进行了miRNA测序分析,对差异表达miRNAs（differentially expressed miRNAs,DEMs）的潜在靶基因进行了GO富集分析和KEGG通路分析,对非差异表达miRNAs（non-DEMs）的潜在靶基因进行了KEGG通路分析,对Rap1信号通路及HIF-1信号通路进行了miRNA-核心基因调控网络的构建。结果表明,两种sEVs亚型之间存在大量差异表达的miRNA;sEVs-F6中显著上调miRNA的潜在靶基因主要富集在MAPK信号通路、Erb B信号通路、Fox O信号通路、Rap1信号通路及AMPK信号通路中;sEVs-F8中显著上调miRNA的潜在靶基因主要富集在细胞自噬和HIF-1信号通路中;两种sEVs亚型中非差异表达miRNA的潜在靶基因显著富集在细胞自噬、p53信号通路、内吞作用、细胞周期、胰岛素信号通路、MAPK信号通路、AMPK信号通路、Erb B信号通路及Fox O信号通路中;两种sEVs亚型中高表达miRNA的潜在靶基因主要参与细胞增殖、凋亡、细胞周期及自噬的调控。（4）牛卵泡液不同sEVs亚型对颗粒细胞增殖和凋亡的作用研究。将两种sEVs亚型分别加入颗粒细胞培养液中,检测颗粒细胞中与增殖凋亡相关miRNAs的摄取、表达量,并进一步检测颗粒细胞的增殖和凋亡。结果表明,两种sEVs亚型处理后颗粒细胞中相关miRNA的表达量显著升高;两种sEVs亚型处理颗粒细胞,均可促进颗粒细胞的增殖,同时抑制颗粒细胞的凋亡,其中sEVs-F8的抑制凋亡的作用更明显。综上所述,卵泡液中存在两种不同的sEVs亚型,其中sEVs-F6为低密度的sEVs,特异性富集的蛋白为TSG101;sEVs-F8为高密度的sEVs,特异性富集的蛋白为CD63。两种sEVs亚型均通过网格蛋白非依赖的途径被颗粒细胞摄取,除共同依赖的摄取途径外,sEVs-F8的摄取还依赖于酪氨酸激酶及磷酸肌醇3-激酶的活性。两种sEVs亚群的miRNA表达谱存在显著差异,除共同参与的信号通路外,sEVs-F6特异性显著富集的通路为Rap1信号通路,sEVs-F8特异性显著富集的通路为HIF-1信号通路。两种sEVs亚型均可携带其高表达的且与增殖凋亡相关的miRNA进入颗粒细胞,促进颗粒细胞的增殖,抑制颗粒细胞的凋亡,其中sEVs-F8抑制凋亡的作用更明显。