罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii)是一种可以用于植物病虫害双防的丝状真菌。与其它虫生真菌杀虫剂一样,基于绿僵菌孢子的生防真菌杀虫剂具有杀虫效果不稳定、保质期短等缺陷;因此,有必要针对绿僵菌等病原真菌的生长发育、致病和抗逆机理进行深入研究,为绿僵菌的商业化开发和提高该菌的生防效果提供理论基础。RNA的加工和降解是调控基因表达的重要步骤,在调节真核生物的生长和发育过程中起着至关重要的作用。非编码RNA的降解依赖5’-3’核酸外切酶的作用,其中5’-3’核糖核酸外切酶(5’-3’ RNA exonuclease,Xrn1)是一个与RNA代谢和RNA干扰等重要功能相关的保守酶大家族,存在于所有真核生物中。此前已有报道发现Xrn1在丝状真菌例如禾谷镰刀菌的生长发育、致病等过程中发挥重要作用。然而,鲜有在昆虫病原真菌包括绿僵菌中的报道,因此,本研究以罗伯茨绿僵菌为研究对象,针对MrXrn1(MAA—09154)在绿僵菌生长发育、致病等过程中的生物学功能进行深入研究。首先,针对MrXrn1的序列特征进行生物信息学分析;其次,利用基因敲除技术、农杆菌介导遗传转化技术结合生化实验等手段,对获得的敲除菌株(MT)、回补菌株(CP)与野生型菌株(WT)进行生物学特性(包括生长发育、抗逆及毒力)比较分析,明确MrXrn1的生物学功能及可能的调控机理。具体的研究结果如下:1.MrXrn1序列特征分析:在NCBI中搜索获得MrXrn1的全长序列,编码1419个氨基酸;保守功能域分析的结果发现在其N端含存在一个XRN_N的保守结构域(Accession:pfam 03159)。进一步构建系统发育树,结果发现其与蝗绿僵菌和莱氏绿僵菌Xrn1的亲缘性较高。2.MrXrn1敲除、回补菌株的获得:根据Xrn1(MAA—09154)所在基因组位置,选择其两端侧翼序列及编码全长序列;构建其敲除载体质粒和回补载体质粒,并通过农杆菌介导转化的方法以及同源重组的方法获得MrXrn1的MT和CP。3.MrXrn1在绿僵菌生长发育过程中的作用分析:将不同菌株(WT、MT和CP)在同等条件下进行培养,观察菌落颜色、大小和形态,同时测定菌落生长直径,计算分析不同菌株产孢量;同时定时观察WT、MT和CP的萌发率,计算获得萌发中时。结果发现:与WT/CP相比较,MT的产孢量下降了 80.91%,孢子萌发中时推迟了 2 h。此外,与WT/CP相比较,MT在菌落颜色、形状大小无明显差异;4.MrXrn1在绿僵菌中逆境压力中作用分析:将不同菌株(WT、MT和CP)进行逆境胁迫分析;不同菌株的孢悬液分别于40℃、45℃水浴和紫外照射处理后,置于PDA培养基上,观察孢子萌发率,计算相对萌发率;结果显示:与WT/CP相比较,在45℃处理条件下,MT相对萌发率下降了 73.10%,结果说明敲除株热耐受能力下降;在紫外线照射下,MT相对萌发率降低了 24.96%,结果说明敲除株对紫外胁迫更敏感;此外,在化学试剂(SDS、NaCl、Congo Red、H2O2、甲萘醌)处理条件下,以相对抑制率为指标(通过不同菌株的生长直径计算),结果发现与WT/CP相比较,MT的相对抑制率无明显变化。5.MrXrn1在绿僵菌中致病力作用分析:针对不同菌株进行生物测定(以大蜡螟Galleriamellonella为试虫),结果显示:在体壁侵染试验中,与WT/CP相比较,MT侵染的大蜡螟存活率更高,进一步计算的半致死时间(LT50)发现,MrXrn1敲除导致毒力显著下降。在直接注射接种试验中,不同菌株侵染后,大蜡螟的存活率没有明显差异。根据这些数据我们推测MrXrn1可能在真菌的孢子粘附或者体壁穿透方面发挥重要作用,进一步对MrXrn1敲除导致毒力下降的机制进行解析,发现与对照组WT/CP相比,MT在疏水表面和蝉翅的附着孢形成比率分别降低了 38.24%和40.64%。综上,研究发现MrXrn1产孢量显著下降,萌发时间相对延迟,对温度变化和紫外敏感性增强,毒力减弱,附着孢减少。这些结果表明MrXrn1对绿僵菌生长发育、抗逆和致病过程起重要调控作用。此研究结果为探究绿僵菌的田间应用提供了基础。