论文部分内容阅读
目的:对化疗药物固有的(innate)和获得性(acquired)抵抗是恶性肿瘤,特别是晚期恶性肿瘤治疗无效和复发的重要原因。大量研究表明细胞凋亡的阻断是肿瘤细胞对DNA损伤性化疗药物发生抵抗的重要机制。肿瘤抑制基因p53在调控细胞对化疗药物诱导DNA损伤的反应中发挥重要作用。ASPP(apoptosis-stimulating proteins of p53)家族蛋白是p53细胞凋亡功能的调节蛋白,包括刺激p53细胞凋亡功能的ASPP1、ASPP2和抑制P53细胞凋亡功能的iASPP。本课题组的研究表明抗肿瘤药物顺铂(cisplatin, CDDP)、吡柔比星(pirarubicin, THP)、β-榄香烯(β-elemene,β-Ele)处理人肺癌细胞系A549和恶性黑色素瘤细胞系A375P,结果表明CDDP和THP可诱导肿瘤细胞发生凋亡,ASPP表达增加,iASPP表达降低,本试验在此基础上采用western blot方法检测了A549细胞的iASPP表达和NF-κB表达,并研究了上述药物对对人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖抑制作用及ASPP家族表达的变化,进一步揭示在肿瘤化疗中ASPP家族与NF-κB之间的关系。方法:运用MTT法筛选4种药物(顺铂,CDDP;吡柔比星,THP;β-榄香烯,β-Ele;长春碱,VLB)的最小有效浓度,对细胞的增殖抑制率;免疫荧光观察药物处理前后NF-κB的表达与定位变化;采用RT-PCR和Western Blot等方法分析各药物处理24h后ASPP2基因mRNA的表达变化、iASPP蛋白在细胞内表达变化。实验数据用SPSS统计软件处理,采用方差分析(ANOVA)数据,P<0.05认为有统计学意义。结果:1)各处理组MTT检测结果显示:β-Ele、THP和VLB对SMMC-7721细胞的生长均有明显的抑制作用。CDDP常规浓度( 3μg/ml)对SMMC-7721细胞增殖抑制作用较弱,β-Ele的抑制作用随浓度的增加而增强(P<0.01),VLB和β-Ele作用24小时后,高剂量处理组与低剂量处理组的抑制率无明显差异。2) RT-PCR结果显示:CDDP和THP处理细胞24h后,SMMC-7721细胞中ASPP2基因mRNA表达量均明显升高(P=0.01,P<0.01),β-Ele和VLB处理组与对照组相比,细胞中ASPP2基因mRNA表达量变化不明显(P=0.185)。3)Western Blot结果表明与对照组相比,SMMC-7721和A549细胞经THP作用24h后,iASPP蛋白相对表达量明显降低,但是SMMC-7721细胞CDDP和β-ELE处理组iASPP蛋白的表达变化不明显。4)免疫荧光结果显示:三药物处理组细胞密度与对照组相比明显降低,而且细胞形态也发生变化,CDDP和β-榄香烯处理的A549细胞NF-κB未出现核内转位,其表达集中在胞质中。THP处理细胞后胞质亮度低于对照组细胞,提示胞浆中NF-κB含量降低,可能转位到细胞核。结论:THP、β-榄香烯对人肝癌细胞SMMC-7721和人非小细胞肺癌细胞A549都有一定抗肿瘤作用。诱导ASPP2表达和抑制iASPP表达以调节肿瘤细胞的细胞凋亡反应可能是THP的抗肿瘤作用的重要机制;SMMC-7721对CDDP并不敏感,药物处理后iASPP表达未发生明显改变,提示iASPP表达的变化可能与肿瘤细胞的药物抵抗有关。A549的研究表明THP对NF-κB可能有激活作用,NF-κB与ASPP家族在调节肿瘤细胞对化疗药物反应性方面的相互作用及其机制仍有待于深入研究。