背景:在世界范围内乳腺癌是女性最常见的癌症,占所有女性癌症发病率的16%。乳腺癌的发病受多种环境和遗传因素的影响,遗传性状、年龄和激素被认为是最主要的易感危险因素。女性乳腺癌为包括多种特征的肿瘤,其在形态学、生物学及分子学特征上各有不同,进而导致了临床预后和患者生存期的不同。目前,我们已经有很多较好的用来诊断以及判断预后的方法和分子标志物,如肿瘤分期和分级,P53,Bcl-2,Ki-67,激素受体等。然而迫切的需要我们鉴别乳腺癌的分子亚型(例如,luminal A and B,基底细胞样型,三阴乳腺癌型等),这些乳腺癌的分子亚型与治疗密切相关,不同的分子亚型对于相同的治疗有不同的预后和治疗反应。三阴乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)及人类表皮生长因子受体(HER-2)的表达均为阴性的乳腺癌,其易复发、转移,缺少有效的治疗方式。每年可有高达40%的乳腺癌患者出现复发转移,这是导致乳腺癌患者死亡的最主要原因。转移性乳腺癌治疗棘手,预后很差,平均生存率低。在研究乳腺癌新的分子标志物中,已经证实MMP家族与乳腺癌的浸润和转移密切相关。MMP家族是锌依赖的肽链内切酶,属于超家族。参与生理过程(例如组织重建、干细胞分化和增殖、凋亡)和病理过程(例如炎症、变性、恶变和癌症)中的关键事件。MMP家族包含多种类型的蛋白酶,分解大部分的细胞外基质成分和一些蛋白,产生对肿瘤发生和进展重要的生长因子,这些数据表明MMP家族可能会成为肿瘤重要的生物学标志和治疗靶点。人类至少有24种MMP基因,产生23种MMP蛋白,包括17种可溶性的分泌蛋白和6种膜相关蛋白酶。MMPs包括多种结构域,其底物特异性和组织特异性的表达模式不同。MMPs是根据其作用的细胞外基质优势底物而命名。胶原裂解作用的MMPs(MMP-1、MMP-8、MMP-13)称为胶原裂解酶。明胶裂解作用的MMPs(MMP-2、MMP-9)被称为明胶酶,广谱的降解ECM蛋白作用的称为间质溶解素(MMP-3、MMP-10、MMP-11)或是基质溶解因子(MMP-7)。随着其他旁系同源MMP的发现,包括膜相关的MMPs,MMP家族不断的增大。MMPs可作为肿瘤的分子生物学标记物和预测转移的指标,对诊断和预后是有帮助的。很多研究发现在MMPs蛋白和mRNA表达水平上的增加,是导致乳腺癌发生和进展的关键事件,通过MMPs可能促使乳腺癌转移。另一方面,最近的研究发现,一些MMPs(如MMP-8)的作用可能为机体提供主动防御性机制,而非刺激肿瘤的发生和发展,这些蛋白酶可能在癌症的过程中有保护的生物学作用。MMP-1作为胶原裂解酶,可以广泛的表达于细胞间质中,并降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原,参与机体的生理及病理过程。有研究表明MMP-1在胃癌、膀胱癌及前列腺癌中的高表达与患者的不良预后密切相关。MMP-1在乳腺癌中的生物学和分子学作用已经开始被研究和分析,很多体内和体外的实验来研究MMP-1在乳腺癌癌变发生中作用,亦发现MMP1在乳腺癌及癌间质中的表达与乳腺癌的进展和不良预后相关。但MMP-1的表达特点和调节机制尚不十分清楚且存在一定的争议。MMP-1在乳腺癌分子分型中的表达、与其他蛋白的相互作用、及MMP-1能否成为乳腺癌新的分子治疗靶点、能否用于治疗易复发转移的难治性乳腺癌等方面均值得我们进一步深入研究。目的:本实验主要研究MMP-1蛋白和mRNA在ER阳性组,HER-2(3+)组和TNBC组中的表达,了解MMP-1蛋白与乳腺癌患者临床病理特征的关系。采用RNA干扰技术使乳腺癌细胞MMP-1基因沉默,并检测MMP-1基因沉默后乳腺癌细胞生物学特性的变化和对乳腺癌细胞信号通路的影响。从而研究MMP-1在乳腺癌发生、发展过程中的作用,为MMP-1作为新的分子靶点引入乳腺癌,尤其是三阴乳腺癌的临床治疗提供理论依据。方法:1.采用免疫组织化学方法检测MMP-1蛋白在99例乳腺癌石蜡标本和15例癌旁组织中的表达情况。乳腺癌标本包括ER阳性组51例,HER-2(3+)组22例,TNBC组26例。观察MMP-1蛋白在乳腺癌细胞及间质中的表达,分析其与临床病理特征的关系及MMP-1蛋白与突变型P53蛋白和Ki67指数之间的关系。2.采用Western-blot方法检测MMP-1蛋白在28例乳腺癌新鲜标本中的表达情况。其中包括ER阳性组14例,HER-2(3+)组7例,TNBC组7例。观察MMP-1蛋白量在各组乳腺癌组织中的表达水平,分析MMP-1蛋白表达量与乳腺癌临床病理特征的关系及其在不同组乳腺癌之间的表达差异。3.采用RT-PCR方法检测MMP-1mRNA在17例乳腺癌新鲜标本中的表达情况。其中包括ER阳性组4例,HER-2(3+)组6例,TNBC组7例。观察MMP-1mRNA的表达情况,分析其在不同组乳腺癌之间的表达差异。4.按照siRNA设计原则,设计针对MMP-1基因的shRNA,构建MMP1-shRNA#1、MMP1-shRNA#2、MMP1-shRNA#3真核表达载体,转染MCF-7细胞,应用Western-blot实验检测转染效率。5.选用沉默效率最高的MMP1-shRNA#2-GV102质粒转染MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞,用细胞免疫组织化学方法检测MMP-1蛋白的表达。分析MMP-1基因沉默后两组细胞中MMP-1蛋白的表达。6.采用MTT法分别检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞的增殖情况。分析沉默MMP1基因后两组细胞的增殖能力。7.采用平板克隆形成实验分别检MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞的的克隆形成数量。分析沉默MMP1基因后两组细胞的克隆形成能力。8.采用流式细胞仪检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组的细胞周期。分析沉默MMP1基因后两组细胞周期的变化。9.采用Transwell侵袭实验和迁移实验检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞的侵袭和迁移情况。分析沉默MMP1基因后两组细胞侵袭和迁移的能力。10.采用划痕愈合实验检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞的迁移情况。分析沉默MMP1基因后两组细胞的迁移能力。11.采用Western-blot方法检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞中c-myc,p-AKT和AKT的蛋白的表达情况。分析MMP1基因的沉默后两组细胞中的c-myc,p-AKT和AKT的蛋白水平的变化。12.采用Western-blot方法检测MCF-7-MMP1shRNA,MDA-MB-231-MMP1shRNA与其相应对照组细胞中Bcl-2,BAX和Cleaved Caspase 3的蛋白的表达情况。分析MMP1基因的沉默后两组细胞中的Bcl-2,BAX和Cleaved Caspase 3的蛋白水平的变化。13.全部的数据分析和统计学处理均采用spss17.0统计软件进行。由于比较对象的不同,根据情况分别采用?2检验、Spearman相关性分析、秩和检验(Kruskall-Wallis H检验)、独立样本T检验(Independent Samplet Test检验)等,以p<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.在乳腺癌组织中,经免疫组化染色MMP-1蛋白既可以表达于癌细胞胞质,又可以表达于癌组织间质。其在癌细胞胞质及肿瘤间质中的阳性表达率在淋巴结转移组较高,高于无淋巴结转移组。MMP-1蛋白在乳腺癌癌旁组织中未见表达。2.MMP-1蛋白在ER阳性组、HER-2(3+)组及TNBC组中的表达率具有明显差异。在TNBC组,MMP-1蛋白在癌细胞胞质中阳性表达率(76.92%,20/26)和在肿瘤间质中的阳性表达率(92.31%,24/26)均高于ER阳性组、HER-2(3+)组。3.MMP-1在癌细胞胞质和肿瘤间质的表达程度与突变型P53的表达程度呈显著正相关。MMP-1在癌细胞胞质和肿瘤间质的表达程度均与ki-67指数呈显著正相关。4.经Western-blot检测显示MMP-1蛋白在ER阳性组、HER-2(3+)组及TNBC组中的表达量具有明显差异。其表达量在TNBC组的表达量最高(33.90±7.56)。5.MMP-1蛋白表达量与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移有关。MMP-1表达量在肿瘤直径>2cm组、临床分期Ⅲ+Ⅳ组、淋巴结转移组较高,高于肿瘤直径≤2cm组、临床分期Ⅰ+Ⅱ组及无淋巴结转移组,且差异具有统计学意义。6.RT-PCR检测结果显示,MMP-1mRNA在三组乳腺癌组织中均有表达。TNBC组中MMP-1mRNA表达量高于ER阳性组、HER-2(3+)组,且差异具有统计学意义。7.应用RNAi载体GV102成功构建了MMP1-shRNA-GV102真核表达载体,稳定转染乳腺癌MCF-7细胞。Western-blot实验证明,各实验组转染后细胞MMP-1蛋白表达水平显著降低。其中MMP1-shRNA#2-GV102质粒的沉默效率最高。8.细胞免疫组化结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中MMP-1蛋白表达比相应对照组显著降低。9.MTT结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7,MDA-MB-231细胞增殖能力显著降低。10.平板克隆实验结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的软琼脂克隆形成率比相应对照组显著降低。11.流式细胞检测细胞周期的结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞与对照组之间相比,GO/G1期细胞数量显著升高,S期和G2/M期细胞数量显著降低。12.Transwell侵袭实验结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞比相应对照组细胞的侵袭能力显著降低。13.Transwell迁移实验结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞比相应对照组细胞的迁移能力显著降低。14.划痕愈合实验结果显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞与比相应对照组细胞迁移能力显著降低。15.经Western-blot检测显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中的c-myc,p-AKT,AKT的蛋白表达比对照组降低。16.经Western-blot检测显示MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中的Bcl-2蛋白表达比对照组降低,BAX和Cleaved caspase 3的蛋白表达比对照组增高。结论:1.乳腺癌组织中,MMP-1蛋白在癌细胞和肿瘤间质中的阳性表达与淋巴结转移相关。与突变型P53的表达程度、ki-67指数呈显著正相关。MMP-1蛋白表达量与肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移有关。提示MMP-1蛋白具有促进乳腺癌进展和转移的作用。2.MMP-1蛋白和mRNA在ER阳性组、HER-2(3+)组及TNBC组的表达具有明显差异。在TNBC组,MMP-1蛋白和mRNA表达明显高于ER阳性组、HER-2(3+)组。3.MMP-1ShRNA的真核表达载体MMP1-shRNA-GV102成功构建,转染乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞后,能够显著的降低MMP-1蛋白的表达。4.MMP-l基因沉默可抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖能力和克隆形成能力。G0/G1期的细胞数呈显著增多,S期和G2/M期的细胞呈明显减少,阻碍DNA合成的正常进行。5.MMP-l基因沉默可导致乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力降低。6.MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中的c-myc,p-AKT,AKT的蛋白表达降低。提示MMP-1基因沉默可能通过调控AKT/c-myc信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖与侵袭。7.MMP-1基因沉默后,乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞中的Bcl-2蛋白表达降低,而BAX和Cleaved caspase 3蛋白表达增高。提示MMP-1基因沉默可能通过促进细胞的凋亡,抑制乳腺癌细胞的增殖。8.MMP-1可以作为乳腺癌易发生淋巴结转移及预后不良的生物学标志物,并且可能成为三阴乳腺癌等难治性乳腺癌的靶向治疗基因。