【摘 要】
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背景:脑卒中是全球死亡人数排在第二的疾病。近年来已被证实的针对缺血性脑卒中有效的治疗方法仅有重组组织纤溶酶原激活剂（Recombinant tissue plasminogen activator,r-t PA）溶栓治疗,但由于其治疗时间窗短,而且缺血后神经元的退化和神经功能的损伤在预后难以恢复。目前,关于脑卒中炎症反应机制的研究提示抑制脑卒中缺血早期促炎反应或成为新的治疗策略。小胶质细胞在生理条
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背景:脑卒中是全球死亡人数排在第二的疾病。近年来已被证实的针对缺血性脑卒中有效的治疗方法仅有重组组织纤溶酶原激活剂（Recombinant tissue plasminogen activator,r-t PA）溶栓治疗,但由于其治疗时间窗短,而且缺血后神经元的退化和神经功能的损伤在预后难以恢复。目前,关于脑卒中炎症反应机制的研究提示抑制脑卒中缺血早期促炎反应或成为新的治疗策略。小胶质细胞在生理条件下发挥抗炎反应作用,清除有害物质,保护神经元。但在脑卒中发生以后,小胶质细胞过度激活引起的促炎反应不仅在缺血性脑卒中早期导致组织损伤,也能造成继发性梗死区扩大。因此抑制小胶质细胞促炎反应的同时维持其抗炎作用可被视为脑卒中治疗的理想策略。目前,虽然已发现大量与细胞凋亡或炎症相关的分子,但在临床治疗中并没有被证实能够发挥有效治疗作用的靶点。目的:从脑卒中后不同时间点转录组测序结果出发,结合差异基因表达谱分析脑卒中炎症反应相关基因。探究脑卒中中小胶质细胞参与炎症反应的分子机制。方法:对4月龄成年雄性C57小鼠进行短暂性大脑中动脉栓塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）或假手术后。采用核磁共振成像、2,3,5-氯化三苯基四唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色和Fluoro-Jade（FJ）染色确定大脑损伤。在MCAO后第1、3、7、14、28天后,分别取缺血模型组小鼠及对照小鼠脑组织进行RNA测序,并筛选缺血后不同时间点差异表达基因。基于时间序列的生信分析方法对差异表达基因进行分组,并结合基因功能富集分析对差异表达基因进行筛选。采用免疫荧光确定小胶质细胞形态及数量变化,采用荧光激活流式细胞术分选小胶质细胞,采用蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附实验确定脑卒中模型中主要炎症因子表达情况。应用腺相关病毒（AAV-PHP.e B-DIO-Hmgb2-I/td T等）条件性敲降Cx3cr1-cre小鼠小胶质细胞中高迁移率家族蛋白B2（High mobility group box 2,Hmgb2）的表达,以明确Hmgb2在炎症反应中的作用。采用染色质免疫共沉淀和双荧光素酶报告实验探究Hmgb2与半胱氨酸组织蛋白酶（Cathepsin S,Ctss）的调控关系。应用Ctss的蛋白酶抑制剂LHVS探究脑卒中治疗策略。采用伊文思蓝染色检测各组小鼠血脑屏障渗透性,采用神经功能缺陷评分检测各组小鼠神经功能。结果:对脑卒中造模后不同时间点的小鼠皮层RNA测序结果进行差异表达基因筛选,发现共有778个编码基因表达增加。我们根据这些基因在缺血后的表达变化趋势其分为三组。结合这些差异表达基因的功能富集分析,我们筛选出缺血早期炎症反应相关因子。通过检测流式分选的Cxc3r-cre小鼠小胶质细胞,发现Hmgb2在缺血早期出现高表达。使用腺相关病毒特异性抑制小胶质细胞中Hmgb2的表达可以减小缺血后水肿面积,降低FJ阳性细胞和M1型小胶质细胞的数量以及促炎因子如IL-1、TNF-α等的表达,同时不影响抗炎因子如IL-10的表达,并减轻脑卒中后小胶质细胞促炎反应,改善神经功能和脑卒中损伤。通过对下游炎症因子的基因功能富集分析,对缺血前后Ctss的表达进行检测发现其表达在缺血后增加。根据JASPAR数据库预测Hmgb2与Ctss可能的结合位点,通过染色质免疫共沉淀和q PCR以及双荧光素酶报告实验验证Hmgb2可以与Ctss启动子区域结合并调控Ctss的转录。缺血后Ctss大量表达并分泌到胞外,引起血脑屏障功能障碍以及炎症反应,使用LHVS抑制Ctss的酶活性,可以有效改善血脑屏障功能以及脑卒中损伤。结论:小胶质细胞中Hmgb2在脑卒中后特异性表达增加并调控Ctss转录参与促炎反应,抑制小胶质细胞中Hmgb2的表达或Ctss的酶活性可以有效防止促炎反应并改善脑卒中损伤。
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