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目的:1、研究IL-10/STAT3信号通路在大鼠外周血间充质干细胞(PBMSCs)体外调节巨噬细胞极化中的作用。2、初步探索大鼠外周血间充质干细胞(PBMSCs)与大鼠外周血间充质干细胞条件培养基(P-CM)对于体外调节巨噬细胞极化的差异。方法:1、大鼠PBMSCs的分离、培养与鉴定:收集粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员后的SD大鼠血液,运用淋巴细胞分离液(Ficoll)吸取单核细胞层,将收集到的细胞接种、培养并传代。取P3代细胞,采用流式细胞术(FCM;CD29、CD90、CD44、CD45、CD79和CD11b)、免疫细胞化学染色(ICC;CD34、CD73、CD105和HLA-DR)及三系分化实验鉴定分离、培养的PBMSCs。2、大鼠M0型巨噬细胞的分离、培养与鉴定:(1)采用L929细胞制备L929条件培养基。(2)收集SD大鼠股骨骨髓腔冲洗液,离心并收集细胞,使用巨噬细胞培养基(含20%L929条件培养基)接种并培养6d,将得到的细胞经FCM(CD68和CD11b)进行表型鉴定。3、PBMSCs与M0型巨噬细胞共培养:本次实验共分为5组:PBMSCs组、巨噬细胞(M0)组、PBMSCs条件培养基与M0条件培养基混合(P-CM+M-CM)组、PBMSCs条件培养基与M0共培养(P-CM+M0)组、PBMSCs与M0共培养(PBMSCs+M0)组。其中M0组、P-CM+M0组和PBMSCs+M0组再分别下设3组:对照(Control)组、Ab9969(IL-10中和抗体)组和Stattic(STAT3抑制剂)组。各组分别于共培养6h、2d和4d后收集上清及巨噬细胞进行相关炎症因子检测;取共培养2d后的巨噬细胞进行通路及极化的相关检测。4、IL-10/STAT3通路作用于巨噬细胞极化相关检测:运用酶联免疫吸附实验(ELISA)和实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)技术检测IL-10、TNF-α和IL-1β的分泌和表达情况;Westernblot(WB)检测JAK和STAT3的磷酸化(JAK/p-JAK和STAT3/p-STAT3)情况;免疫荧光(IF)检测STAT3细胞内分布情况;FCM(CD86和CD206)检测巨噬细胞极化情况。结果:1、外周血所提细胞:形态均一,形似成纤维样细胞贴壁生长;高表达CD29、CD90、CD44、CD73和CD105,不表达或弱表达CD75、CD79、CD11b、CD34和HLA-DR;分别诱导培养后有钙结节、糖胺聚糖以及脂滴形成。2、骨髓腔所提细胞:形态不规则,有伪足,贴壁生长;高表达CD68和CD11b。3、ELISA和RT-q PCR结果显示:1在不同时间点,M0组、P-CM+M-CM组、P-CM+M0组IL-10含量及表达随着三个时间点逐次降低(P<0.05);IL-1β、TNF-α含量及表达随着三个时间点逐次增高(P<0.05)(其中2d的TNF-α含量及表达较4d无明显统计学差异(P>0.05))。PBMSCs+M0组三种因子含量或表达在三个时间无明显统计学差异(P>0.05)。2在不同共培养组中,PBMSCs+M0组、P-CM+M0组分别较M0/P-CM+M-CM组在6h、2d和4d,IL-10含量及表达增高(P<0.01),IL-1β、TNF-α含量及表达降低(P<0.05)(其中PBMSCs+M0组、P-CM+M0组在6h的IL-β较M0组表达增高(P<0.05));PBMSCs+M0组较P-CM+M0组上述作用程度更强(P<0.05)。3加入抑制剂后,Ab9969组/Stattic组较Control组IL-10在三个时间点、三个培养组中的含量及表达均降低(P<0.05);IL-1β及TNF-α在三个时间点、三个培养组中的含量或表达增高(P<0.05)。4、WB、IF及FCM结果显示:P-CM+M0组较M0组、PBMSCs+M0组较M0组及PBMSCs+M0组较P-CM+M0组,JAK1与STAT3磷酸化程度增加(P<0.05),STAT3在细胞核分布增多,M2型巨噬细胞表面标志物CD206阳性细胞比例增加,M1型表面标志物CD86阳性细胞比例降低(P<0.05),而在加了抑制剂之后,上述现象被抑制或消失(P<0.05)。结论:1、PBMSCs及其条件培养基都能够促进巨噬细胞分泌M2型巨噬细胞标志性的抗炎因子IL-10的表达和分泌,同时抑制M1型巨噬细胞标志性促炎因子TNF-α和IL-1β的表达和分泌。2、PBMSCs及其条件培养基可通过激活IL-10/STAT3信号通路,调控巨噬细胞向M2型巨噬细胞方向极化,促进抗炎因子的表达和分泌,同时抑制促炎因子的表达和分泌。3、PBMSCs与其条件培养基在调节巨噬细胞炎症因子表达与释放以及在调节巨噬细胞极化能力方面存在差异。其中PBMSCs对于巨噬细胞炎症因子表达与释放的控制一直维持在较高水平,而P-CM的调控作用随着时间延长效果降低,呈现出时间依赖性。