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团头鲂(Megahbramaamblycephala)是我国重要的草食性经济鱼类,而水体中氨氮含量过高是促使团头鲂发病的重要影响因素,严重制约其高密度养殖模式的发展。溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性球蛋白,又称N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是机体免疫机能评价指标之一,它的表达可以增强巨噬细胞的吞噬功能,清理受损或感染细胞。Caspase(cysteinylaspartate specific proteinase)是一类具有天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶,几乎参与所有凋亡通路的级联反应,是细胞凋亡的核心。为了解g型溶菌酶、caspase9、caspase8基因序列特征及其在团头鲂氨氮胁迫过程中的作用,应用末端快速扩增(rapid amplication of cDNA ends,RACE)技术克隆了团头纺g型溶菌酶、caspase9以及caspase8全长cDNA序列,并应用荧光定量PCR检测了各基因在氨氮胁迫不同时间的表达变化,为进一步了解团头鲂应答氨氮胁迫分子机制提供理论依据。主要研究结果如下:1.g型溶菌酶基因全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析克隆得到全长719 bp的cDNA序列,包括71 bp的5’末端非翻译区(untranslated regions,UTR),90 bp 的 3’UTR,558 bp 的开放阅读框(open reading frame,ORF);氨基酸相似度比对显示,不同鱼类g型溶菌酶的氨基酸序列之间具有较高的保守性,系统进化树分析表明,该基因与草鱼(Ctenopharyngodonidella)g型溶菌酶亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示g型溶菌酶基因在团头鲂各组织中均有表达,肠道中表达量最高,同时在胁迫和恢复过程中该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫时表达量上调,恢复后表达量相对下降,而g型溶菌酶在鳃中的表达有所不同,可推测g型溶菌酶基因参与氨氮应激分子过程。2.Caspase 9基因全长cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析得到全长 1613 bp 的 cDNA序列,包括 185 bp 的 5’UTR,96 bp 的 3’UTR,1332 bp的ORF。氨基酸多序列比对显示平均同源性为77.74%,表明团头鲂caspase9基因具有较高的保守性;系统进化分析表明,该基因氨基酸序列与其他鱼类caspase9聚为一支并与锦鲤(Cyprinuscarpio)caspase9亲缘关系较近;荧光光定量PCR结果显示caspase9基因在团头鲂各组织中均有表达,在脑中表达量最高,肌肉中表达量最低,同时在胁迫和恢复过程中该基因在肝和脑中的表达规律相似,均在胁迫期间出现表达量上调,整体呈类似波浪形表达谱。研究结果提示,氨氮胁迫下caspase9基因参与团头鲂的免疫防御,并与细胞凋亡分子过程有关。3.Caspase 8基因cDNA克隆及在氨氮胁迫下的表达分析克隆到caspase 8基因全长cDNA序列2034 bp,包括102 bp的5’ UTR,462 bp的3’UTR,1470bp的ORF,编码489个氨基酸残基。利用该序列进行氨基酸多序列比对,显示平均同源性为59.56%,表明团头鲂caspase8基因保守型较强;系统进化树分析显示,团头鲂caspase8基因氨基酸序列与其他鱼类该基因聚为一大支并与鲤鱼(Cyprinuscarpio)和斑马鱼(Danio rerio)亲缘关系较近。荧光定量PCR结果显示caspase 8在所检测的6个组织肠道、肝脏、脑、肾脏、鳃和肌肉中均有表达,其在脑中的表达量最高,在肌肉和鳃中表达较低,同时在胁迫和恢复应激过程中,该基因在脑和肝中的表达规律相似,均在胁迫过程中表达量上升并在胁迫后72h表达量达到最大值,恢复后表达量有所回落,结果显示caspase8参与了氨氮胁迫应激过程。