背景:结直肠癌是一种发生在结肠和（或）直肠中的癌症。结直肠癌的男性发病率在所有癌症中排名第三,女性发病率排名第二。根据国际癌症研究机构2018年的统计,结直肠的致死率在所有癌症中排名第二。无论是环境还是遗传因素的改变,都可能造成结肠上皮细胞内发生基因组不稳定、基因突变、DNA修复机制沉默等癌症特征事件,从而导致结直肠癌的发生。另一方面,基因组及表观基因组稳定性的丧失,也会加速原癌基因、抑癌基因的基因突变和表观遗传改变的发生。然而,结直肠癌的形成,往往需要大量的突变累积,表观遗传的改变可能需要10-15年的时间才会出现症状。最近,研究人员发现了突变负荷与临床疗效之间的联系,许多不同组织来源的癌症,其突变数都与预后表现出了显著的相关性:突变数更高的患者拥有更高的生存率及更低的死亡风险。另外,在结直肠癌中,APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、TCF7L2和NRAS等基因发生突变的概率最高。而对于三期或高危二期的结直肠癌患者来说,高肿瘤突变负荷往往有着更好的预后。ABO血型系统是最常用的人类血型分类系统。该系统根据人体内的两种抗原（A抗原和B抗原）将血液分为四种类型（A,B,AB和O型）。ABO血型系统的抗原在红细胞以及几种其他组织来源细胞（如胃肠道来源细胞）的表面都有表达。据报道,在IP测定中测试了23个远端结肠的原发性腺癌样本（包括降结肠,乙状结肠和直肠）,其中22个表达Y半抗原,19个表达H2型抗原。在全部5个近端结肠原发性腺癌样本（包括盲肠,升结肠和横结肠）中,Y半抗原和H-2抗原均呈阳性。早在60多年前,研究者们就开始关注ABO血型在癌症生物学中的作用,并确认了ABO抗原和几种肿瘤（如胰腺癌和胃癌）的发生具有相关性。A型血的人患有胃癌,胰腺癌,乳腺癌,卵巢癌和鼻咽癌的概率都要高于非A型血的人群。最近的研究表明,血型与结直肠癌风险之间可能存在相关性。A型血的个体发生直肠癌的概率要高于O型血的群体,而AB型血的人结肠癌的预后更佳。那么,ABO血型与结直肠癌患者肿瘤基因突变负荷之间是否存在着相关性,这种相关性又对结直肠癌的早期诊断有着怎样的指导价值,都是值得我们思考的问题。为了研究ABO血型与结直肠癌之间的相关性,我们评估了血型和结直肠癌患者突变负荷的联系。在本研究中,我们使用了基于实验室设置的靶基因多重PCR文库（968个热点区域文库和48个癌症易感基因文库）二代靶向测序技术对结肠癌体细胞突变进行测序。在建库时使用ligated和分子条形码技术,使用Illumina Hiseq X-TEN平台进行测序（双端测序,2×150 bp）获得FASTQ格式的原始文件,随后使用多种生物信息学方法对癌和癌旁组织的原始文件进行突变频率计算,最后使用Snp Eff进行注释获得基因组的突变信息。研究结果显示,A型血的患者突变负荷高于其他血型（B,O,AB型）。O型血的突变负荷显著低于A型血（P≤0.05）。另外,肿瘤尺寸、肿瘤分期等临床数据也和ABO血型有着相关性。例如,A型血的结直肠肿瘤尺寸显著小于B型血（P≤0.05）。这一结果对于肿瘤发病率的评估和治疗方案的选择有着重要的指导意义。研究目的:血型被认为是一种重要的遗传因素,可能与结直肠癌相关。研究评估了血型和结直肠癌相关基因突变的联系,并计算了患者的平均突变数。（1）通过第二代测序（靶向测序）技术检测了结直肠癌患者切除的肿瘤和癌旁组织中的突变类型、突变数目和突变基因。（2）观察结直肠肿瘤样本中基因突变的频率,探究不同ABO血型、不同肿瘤解剖位置的基因突变频率。（3）探讨结直肠癌患者ABO血型与肿瘤突变负荷之间的潜在关系。（4）结合结直肠癌患者体内的肿瘤病理特征,如肿瘤大小,肿瘤分期和肿瘤位置/来源,进一步探究血型与肿瘤突变负荷之间的相关性。材料与方法:实验流程如下:首先从所有组织中提取结肠DNA分子,然后按照扩增子文库制备方案扩增DNA样本。这种DNA测序方法被认为是鉴定结直肠癌突变的金标准。本实验在2013年至2016年间收集了来自19个结直肠癌患者的57份样本,包括新鲜肿瘤、癌旁组织和正常组织,运用二代测序技术对收集的样本进行靶向建库测序。靶向位点为结直肠癌癌症易感基因和突变热点区域。所有目标文库均已发送给测序公司,分析时将数据按分子条码进行分组,并检测了每个位置上的的碱基,以构建新的单链序列,检测突变并选择高可信度突变。我们使用了不同的软件程序来分析不同结直肠癌肿瘤组织和癌旁组织样本中突变的类型和频率,以确保结果准确、可靠、合理。数据分析流程:1使用Fast QC评估数据质量;2使用p Trimmer去除引物序列;3使用BWA将reads比对到参考基因组hg38上;4使用Samtools去除比对到多个位置的reads;5使用GATK4 Mutect2检测突变;6使用Py Clone分析样本肿瘤细胞比例。最后,我们会得到一个肿瘤基因总突变数的excel文件,使用excel内的计算工具计算平均突变数。此外,还检测了肿瘤分期、肿瘤大小和ABO血型之间的关系。所有统计分析和作图均使用R软件进行。ABO血型和临床参数的P值均采用Wilcoxonsigned rank检验。P值≤0.05被视为差异有统计学意义。结果:本研究成功构建了基因文库,测序得到的结果稳定且符合预期。研究发现,在ABO血型中,A型血受TP53和APC基因突变的影响最大。与其他血型相比,A型血样本中TP53、APC突变的频率也是最高的（分别为TP53:75%;APC:85.71%;KMT2C:75%;KRAS:50%）。此外,大多数变异都是错义突变、同义突变和无义突变。在检测突变负荷之后,可以将其与ABO血型做对照,探究哪种血型与高突变数相关。通过分析19个结直肠癌病人的肿瘤组织样本,我们首次发现,血型和结直肠癌症相关基因的突变数之间存在相关性。A型血患者的平均突变数比其他血型（B型、O型、AB型）的患者要高,而O型血的突变数最低（P≤0.05）。A型血的平均突变数为（12.142）,B型血的平均突变数为（8.4）,O型血的平均突变数为（6）。一方面,大多数结直肠癌A型血患者,在确诊时或化疗前都处于第二或第三癌症阶段（TNM分期为T2和T3）。此外,A型血的患者,其癌症解剖位置多集中在直肠和乙状结肠部分,病理分型为直肠和乙状结肠腺癌。另一方面,观察到O型血型患者多为晚期癌症（T4期）,三例位于右结肠侧（RCS）,一例发生肝转移,而其他B型血的患者们多处于T2或T4。一个新发现是,在结直肠癌患者中,A血型的肿瘤明显小于B血型的（P≤0.05）。临床变量控制分析显示,A型血患者似乎具有更高的平均突变负荷,更小的肿瘤体积,以及更早期的肿瘤分期。结论:我们的研究首次证明了结直肠癌患者ABO血型与肿瘤基因突变负荷之间存在相关性。研究结果表明,A型血患者的肿瘤基因平均突变负荷更高,而非A型血患者的平均肿瘤基因突变数较少。另一方面,与O型和B型血相比,A型血的肿瘤大小明显更小（P≤0.05）。除此之外,我们还发现,A型血患者的肿瘤大多来源于直肠和乙状结肠,且在确诊时大多处于T2或T3期,而O型血患者大多已达到T4期。根据这些结论,公共卫生部门可以为那些具有高突变负荷相关血型的人群,制定年度体检及随访计划,做到结直肠癌的早发现、早诊断和早治疗。研究结果可能对结直肠癌的早期诊断及抗癌新药研究具有指导价值。