论文部分内容阅读
对虾白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是引起养殖对虾大规模死亡的主要病毒性病原之一，目前在分子或基因水平上研究其流行病学、理化特性、基因、蛋白特性等已取得了一些突破性的进展。随着全基因组序列的公布，研究学者对WSSV功能基因的研究主要集中在病毒囊膜蛋白的研究，目前已经确定的囊膜蛋白有VP28，VP26， VPl9，VP466和VP37等20多种。囊膜蛋白可以同宿主细胞膜上的特异受体结合并介导病毒包膜和宿主细胞膜的融合，从而启动病毒进入宿主细胞，现已发现PmRab7、β-integrin、Hsc70、BP53、PmCBP和STAT等宿主蛋白可以和WSSV囊膜蛋白结合。PmRab7是斑节对虾体内的一种小GTP结合蛋白，有研究表明该蛋白与WSSV囊膜蛋白VP28特异性结合，并且其重组蛋白或抗体都可以降低WSSV感染对斑节对虾的死亡率；另有RNA干扰结果表明，注射dsRNA-PmRab7沉默pmrab7基因的表达能够抑制WSSV和黄头病毒(yellow head virus，YHV)对斑节对虾的感染，推测PmRab7可能参与了病毒复制过程中的内吞运输。综上所述，Rab7在对虾防御WSSV中所起的作用不容忽视，但该蛋白是否分布在细胞膜上以受体身份参与WSSV感染，还是分布在细胞内以结合因子身份参与感染目前尚未知。本论文通过研究中国对虾体内的Rab7与VP28的定位关系，解析二者相互作用的功能区域，为进一步阐明Rab7在WSSV发生与发展过程中的作用机制提供了理论依据。本研究主要包括4部分：利用cDNA末端扩增（RACE）技术克隆中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）Rab7基因（pcrab7）全长cDNA；通过构建重组原核表达载体pBAD/gIIIA-pcrab7，诱导表达和纯化PcRab7蛋白，并制备PcRab7多克隆抗体；利用免疫印迹结合法（Western Blot）、Dynabeads磁珠免疫结合法和荧光免疫分析（FIA）检测VP28和PcRab7的作用及二者的具体结合位点；利用免疫荧光细胞化学染色通过激光共聚焦显微镜分析Rab7在中国对虾血淋巴细胞中的定位以及与VP28的关系。1、中国对虾Rab7基因（pcrab7）全长cDNA克隆：利用RACE方法成功克隆了中国对虾pcrab7全长cDNA (GenBank：JF742050），并对该基因进行了生物信息学分析。pcrab7全长1369bp，含有1个615bp开放阅读框，编码205个氨基酸，编码产物的估算分子量23.2KD。通过对pcrab7编码蛋白的序列分析显示，该基因产物具有许多Rab蛋白家族成员的共同特征，其氨基酸序列与凡纳滨对虾和斑节对虾的PcRab7蛋白的同源性为100%，其基因序列与凡纳滨对虾和斑节对虾的pcrab7基因的同源性分别为96%和97%。2、PcRab7蛋白表达及多克隆抗体制备：构建重组表达载体pBAD/gIIIA-pcrab7，转化到大肠杆菌E. coli内，用L-阿拉伯糖在37℃诱导重组基因工程菌，经SDS-PAGE和对表达序列标签（6×His）的检测，鉴定得到重组的目的蛋白，并利用纯化的重组蛋白制备了兔抗PcRab7多克隆抗体。3、VP28与PcRab7的结合及作用区域的分析：通过Western Blot和Dynabeads磁珠免疫结合法验证了PcRab7能与VP28结合；并且通过构建PcRab7的基因缺失片段，利用Western Blot和FIA进一步分析了VP28和PcRab7的具体结合位点，初步发现PcRab7的第41-79AA和第125-160AA这两个片段与VP28有结合活性。4、PcRab7与VP28在中国对虾血淋巴细胞中的定位分析：利用免疫荧光细胞化学染色法通过激光共聚焦显微镜对PcRab7在中国对虾血淋巴细胞中进行了定位，结果表明PcRab7主要分布在细胞膜内，膜外几乎没有PcRab7的分布；通过PcRab7与VP28的共定位分析，发现PcRab7与VP28以均匀结合的方式分布在细胞膜内，仅少数点状分布在细胞膜外；提前加入VP28可促使PcRab7在细胞膜外的分布。本论文为进一步研究PcRab7与VP28在WSSV感染过程中的作用机制奠定了基础。