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十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. Campestris，Xcc)，是一种引起十字花科植物发生黑腐病的典型的植物病原菌，它能够通过植物叶片的伤口或者水孔进入到维管束组织进行定殖。在维管束中，Xcc分泌的胞外多糖、胞外酶能够限制植物组织营养物质的运输，破坏植物组织结构，为自身营造合适的营养环境。作为被侵染的宿主，植物体会通过一系列的防御反应来应对病原微生物的入侵，主要包括ETI(effector triggered immunity)和PTI(PAMPs triggered immunity)途径激起的氧化物、有机酸等抗性物质等以限制或者降低病原微生物的活性。而Xcc经过长时间的进化，也形成了一套避开、抵御宿主防御反应的生理机制和结构。其中Ⅲ型分泌系统是一个十分重要的、能够影响和抵御宿主防御反应的分泌装置，其运输的III型效应因子能够进入宿主细胞内并且影响宿主细胞的代谢表达，从而干扰宿主的防御反应。
已知Xcc的Ⅲ型分泌系统由一系列hrp基因的表达产物组装而成，而hrp基因在Xcc基因组中
以若干基因簇紧密连接，形成一个致病岛，这些hrp基因形成的基因簇由关键性的HrpX和HrpG调控，而hrp基因的失活，往往是造成Xcc丧失在宿主植物上的致病力和非宿主植物上引起过敏反应(hypersensitive reaction, HR)的能力的重要原因。近年来，围绕该调控线路开展的研究已经报导了HpaS、RavR、HpaP、HpaR1、HpaR等不同类型的蛋白能够以不同的方式对Ⅲ型分泌系统进行调控。
在实验室前期的工作中，本研究通过对突变体库的致病性检测，得到了一株致病力下降显著的突变体，编号为0520nk。根据突变体库注释显示，该突变体是由Xcc8004菌株的基因组上一个编号为XC_0520的基因被自杀质粒pk18mob插入诱变而来。根据Uniprot(https://www.uniprot.org/)的注释，XC_0520是一个可能的Fis家族的DNA结合蛋白(putative Fis like DNA binding protein)，本研究中简称Flp(Fis-like protein)。该基因以及在黄单胞菌属中与之同源的基因均未有详细研究。
为了进一步确认Xcc中flp与致病性的关系，本研究利用DNA同源交换的方法对Xcc基因组中的基因flp进行缺失突变，得到突变体Δflp，同时对该突变体进行反式互补，得到功能互补菌株CΔflp。本研究以Xcc的宿主植物甘蓝作为实验材料，对Xcc野生型菌株8004、突变体Δflp以及回补菌株CΔflp的致病性进行了检测，发现Δflp的致病性较8004和CΔflp显著降低。同时本研究也对以上菌株的其他表型进行检测，发现Δflp的运动性、对部分抗性物质的抗逆性，以及产胞外多糖的能力均有下降、但是纤维素酶和淀粉酶的活力增加。此外，值得注意的是，本研究以非宿主植物——辣椒为检测材料进行过敏性反应(HR)诱导检测发现，Δflp引起的HR显著延迟，意味着Flp与Ⅲ型分泌系统之间存在某种关系。
为了深入研究Flp与Ⅲ型分泌系统之间的关系，本研究检测了一系列hrp基因在8004、Δflp和CΔflp中的表达情况。发现hrpB、hrpF、hrpF以及编译一个AraC转录调控因子hrpX的在Δflp中表达下降，而hrpX是调控hrp基因簇的一个关键上游位点，Flp很有可能通过调控hrpX进而影响hrp基因的表达。
鉴于Flp被预测为一个DNA结合蛋白(DNA binding protein, DBP)，因此，为了进一步探究Flp对hrpX的调控机理，本研究通过凝胶阻滞实验检测了Flp与hrpX启动子区DNA相互作用的情况，发现随着体系中Flp浓度的提高，Flp-hrpXpromoter形成的阻滞条带也逐渐增强，证明Flp能够与hrpX的启动子区结合，同时通过优化后的基因组免疫共沉淀实验发现，Flp也能够与hrpX启动子区在体内环境发生相互作用。
为了能够评估hrpX对Δflp致病性降低的影响程度以及进一步确认Flp与hrpX的调控关系，本研究将携带hrpX基因组成型表达的质粒p3X导入到突变体Δflp中得到重组菌株Δflp(p3x)，并检测该菌株的致病性和HR诱导能力，结果发现p3X能够将突变体Δflp的HR诱导回补至野生型水平，但是对致病性的提升很小，因此推测Flp对致病性的贡献须III型分泌系统之外的组件来维持。为了能够缩小这些组件的寻找范围，同时为后续工作打下基础，本研究根据转录组数据筛选了一批可能与致病性相关的基因。根据转录组结果，Δflp比8004共有279个基因表达差异显著，其中有158个基因下调，121个基因上调，由此能够得知Flp是一个能够影响广泛的全局性转录调控因子。在以上279个差异表达基因中，XC_2827、XC_3694、XC_3129对应的整合突变体的致病性均有不同程度的下降，同时这些基因的预测的启动子区(ORF上游区域)能够被Flp结合。这也意味着Flp具有对这些与致病相关基因进行直接调控的可能。
综上所述，本研究(1)第一次在十字花科黑腐病菌中揭示了flp对能够影响Xcc的致病性、抗逆性、胞外酶等表型；(2)flp对维持III型分泌系统正常表达至关重要；(3)flp是一个全局性调控因子；(4)flp是维持致病性的一个关键基因，不仅控制III型分泌系统，同时还调控于III型分泌系统以外的致病基因。
已知Xcc的Ⅲ型分泌系统由一系列hrp基因的表达产物组装而成，而hrp基因在Xcc基因组中
以若干基因簇紧密连接，形成一个致病岛，这些hrp基因形成的基因簇由关键性的HrpX和HrpG调控，而hrp基因的失活，往往是造成Xcc丧失在宿主植物上的致病力和非宿主植物上引起过敏反应(hypersensitive reaction, HR)的能力的重要原因。近年来，围绕该调控线路开展的研究已经报导了HpaS、RavR、HpaP、HpaR1、HpaR等不同类型的蛋白能够以不同的方式对Ⅲ型分泌系统进行调控。
在实验室前期的工作中，本研究通过对突变体库的致病性检测，得到了一株致病力下降显著的突变体，编号为0520nk。根据突变体库注释显示，该突变体是由Xcc8004菌株的基因组上一个编号为XC_0520的基因被自杀质粒pk18mob插入诱变而来。根据Uniprot(https://www.uniprot.org/)的注释，XC_0520是一个可能的Fis家族的DNA结合蛋白(putative Fis like DNA binding protein)，本研究中简称Flp(Fis-like protein)。该基因以及在黄单胞菌属中与之同源的基因均未有详细研究。
为了进一步确认Xcc中flp与致病性的关系，本研究利用DNA同源交换的方法对Xcc基因组中的基因flp进行缺失突变，得到突变体Δflp，同时对该突变体进行反式互补，得到功能互补菌株CΔflp。本研究以Xcc的宿主植物甘蓝作为实验材料，对Xcc野生型菌株8004、突变体Δflp以及回补菌株CΔflp的致病性进行了检测，发现Δflp的致病性较8004和CΔflp显著降低。同时本研究也对以上菌株的其他表型进行检测，发现Δflp的运动性、对部分抗性物质的抗逆性，以及产胞外多糖的能力均有下降、但是纤维素酶和淀粉酶的活力增加。此外，值得注意的是，本研究以非宿主植物——辣椒为检测材料进行过敏性反应(HR)诱导检测发现，Δflp引起的HR显著延迟，意味着Flp与Ⅲ型分泌系统之间存在某种关系。
为了深入研究Flp与Ⅲ型分泌系统之间的关系，本研究检测了一系列hrp基因在8004、Δflp和CΔflp中的表达情况。发现hrpB、hrpF、hrpF以及编译一个AraC转录调控因子hrpX的在Δflp中表达下降，而hrpX是调控hrp基因簇的一个关键上游位点，Flp很有可能通过调控hrpX进而影响hrp基因的表达。
鉴于Flp被预测为一个DNA结合蛋白(DNA binding protein, DBP)，因此，为了进一步探究Flp对hrpX的调控机理，本研究通过凝胶阻滞实验检测了Flp与hrpX启动子区DNA相互作用的情况，发现随着体系中Flp浓度的提高，Flp-hrpXpromoter形成的阻滞条带也逐渐增强，证明Flp能够与hrpX的启动子区结合，同时通过优化后的基因组免疫共沉淀实验发现，Flp也能够与hrpX启动子区在体内环境发生相互作用。
为了能够评估hrpX对Δflp致病性降低的影响程度以及进一步确认Flp与hrpX的调控关系，本研究将携带hrpX基因组成型表达的质粒p3X导入到突变体Δflp中得到重组菌株Δflp(p3x)，并检测该菌株的致病性和HR诱导能力，结果发现p3X能够将突变体Δflp的HR诱导回补至野生型水平，但是对致病性的提升很小，因此推测Flp对致病性的贡献须III型分泌系统之外的组件来维持。为了能够缩小这些组件的寻找范围，同时为后续工作打下基础，本研究根据转录组数据筛选了一批可能与致病性相关的基因。根据转录组结果，Δflp比8004共有279个基因表达差异显著，其中有158个基因下调，121个基因上调，由此能够得知Flp是一个能够影响广泛的全局性转录调控因子。在以上279个差异表达基因中，XC_2827、XC_3694、XC_3129对应的整合突变体的致病性均有不同程度的下降，同时这些基因的预测的启动子区(ORF上游区域)能够被Flp结合。这也意味着Flp具有对这些与致病相关基因进行直接调控的可能。
综上所述，本研究(1)第一次在十字花科黑腐病菌中揭示了flp对能够影响Xcc的致病性、抗逆性、胞外酶等表型；(2)flp对维持III型分泌系统正常表达至关重要；(3)flp是一个全局性调控因子；(4)flp是维持致病性的一个关键基因，不仅控制III型分泌系统，同时还调控于III型分泌系统以外的致病基因。