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皱褶假丝酵母脂肪酶(Candida rugosa lipase,CRL)被认为是一种多才多艺、很有前景的生物催化剂,在制药、食品、化妆品、能源等领域具有广泛的应用。CRL商品酶主要由野生型菌株ATCC 14830和Type VII生产,目前已知由8种同工酶组成,其中CRL1具有最高的表达量和酶活力。不同商品酶之间由于同工酶的成分和比例不同,在底物选择性和催化效率上表现出显著差异。分离或生产单一的皱褶假丝酵母脂肪酶,尤其是CRL1,对开展进一步研究工作具有重要意义。毕赤酵母是目前应用最为广泛的外源蛋白表达系统,有利于外源蛋白的高效表达和工业生产。毕赤酵母表面展示体系是一种经济有效的酶固定化手段,可以有效提高酶的稳定性和重复利用效果、降低生产成本。本文以毕赤酵母为宿主细胞,分别构建皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1的高效分泌表达和高效表面展示重组菌株,发酵生产脂肪酶催化剂。在此基础上,研究了两种类型重组CRL1的酶学性质,然后建立并优化了无溶剂体系中CRL1催化合成维生素E醋酸酯的绿色制备工艺体系,为其大规模工业化应用奠定了基础。本文的主要研究内容和结果如下:(1)将经密码子优化的CRL1基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHKA,构建重组菌株GS115/pHKA-CRL1,经摇瓶发酵、甲醇诱导120 h,对底物对硝基苯酚丁酯的水解活力达到39.73 U/mL。通过对AOX1启动子和α分泌信号肽同时进行改造,获得重组菌株GS115/pHKA-AOX1m/αm-CRL1,脂肪酶活力提高60.18%,达到63.63 U/m L。发酵液上清液经过超滤浓缩、硫酸铵沉淀后脱盐和阴离子交换层析,获得纯化后的重组CRL1:比酶活为984.52 U/mg,纯化倍数5.41倍,回收率33.81%。重组CRL1的最适温度为40℃,最适pH为7.5;热稳定性和pH稳定性较差。经3 L补料分批发酵验证,高表达分泌型重组菌株的脂肪酶活力可达到910 U/mL,相对摇瓶水平提高13倍左右。(2)以改造后絮凝素Flo1p的N端絮凝功能域FS为锚定蛋白,首次实现了皱褶假丝酵母脂肪酶CRL1在毕赤酵母细胞的高效表面展示。在提高基因剂量的基础上,过表达内质网折叠促进因子HAC1,筛选到一株酵母重组菌株GS115/pKZA-5FSCRL1-HAC1,摇瓶发酵水平脂肪酶活力达到19,800 U/g,相对单拷贝菌株GS115/pKFS-CRL1提高164%,为目前已知酵母展示脂肪酶中水解活力最高水平。流式细胞仪检测结果证明CRL1成功展示在毕赤酵母细胞表面,定量分析结果表明CRL1在毕赤酵母细胞表面的展示效率在90%以上。表面展示CRL1的最适温度为50℃、最适pH为8.5;同时热稳定性和pH稳定性较游离酶均有明显高。同时研究了金属离子、金属螯合剂、表面活性剂和有机溶剂对表面展示CRL1酶活力的影响。此外,高表达表面展示重组菌株在3 L补料分批发酵中的水解活力为18,800 U/g,与摇瓶发酵水平相当。(3)以毕赤酵母重组表达CRL1为催化剂,建立了无溶剂体系中微生物酶法催化合成维生素E醋酸酯的绿色制造工艺方法。最适反应条件为:200 mg D-α-生育酚、1 m L乙酸酐、100 mg CRL1、反应温度60℃、转速200 rpm、反应时间9 h,D-α-生育酚的转化率在97.00%以上。反应混合物经碳酸钠中和、抽滤、正己烷洗涤和减压蒸馏等纯化步骤,收获维生素E醋酸酯产品:外观呈浅黄色油状,纯度为96.50%(HPLC)、初步达到QB2483-2000标准(>96.0%)。维生素E醋酸酯产品经过FTIR和GC-MS检测得到进一步表征和确认。