【摘 要】
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目的:探究钙调磷酸酶PPP3CB与转录因子TWIST1相互作用调控肾癌(Renal cell carcinoma,RCC)发生发展,并阐述其机制。方法:基于课题组以往研究中质谱分析结果显示,PPP3CB在上皮
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目的:探究钙调磷酸酶PPP3CB与转录因子TWIST1相互作用调控肾癌(Renal cell carcinoma,RCC)发生发展,并阐述其机制。方法:基于课题组以往研究中质谱分析结果显示,PPP3CB在上皮样肾脏间充质细胞m K4中高表达,在间质样肾脏间充质细胞m K3细胞中低表达,因此我们进一步在肾癌细胞系中研究PPP3CB是否在肾癌上皮间质转化(EMT)及发生发展中发挥调节作用。肿瘤蛋白数据库分析显示,PPP3CB低表达于肾癌组织,因此我们在肾癌细胞系786-O和OSRC-2中进行如下实验:体外,在786-O和OSRC-2细胞中通过慢病毒感染方式,构建PPP3CB过表达和敲低的稳定细胞系或利用lipofectamine2000转染si RNA-PPP3CB;通过划痕/Transwell实验,检测PPP3CB对细胞迁移能力的影响,通过Western-blot和免疫荧光实验检测PPP3CB对EMT过程及TWIST1的影响,鬼笔环肽染色F-actin检测细胞骨架改变;在HEK 293FT细胞中,通过Co-IP实验检测PPP3CB与TWIST1相互作用;在PPP3CB稳定细胞系或转染si RNA-PPP3CB的786-O细胞系中,通过CCK-8/MTT及流式细胞术/Western-blot检测剪切的促凋亡蛋白Caspase3分别探究PPP3CB对细胞增殖能力、凋亡能力的调节。在体内,将过表达PPP3CB的786-O稳定细胞系经皮下注射到BALB/c裸鼠腋下,成瘤并监测肿瘤生长。进一步在Kaplan Meier数据库分析肿瘤生存率,收集肾癌临床样本,免疫组化检测PPP3CB表达情况。结果:细胞生物学行为检测结果显示PPP3CB抑制786-O细胞迁移、增殖,促进786-O和OSRC-2细胞凋亡。Western-blot检测EMT标志蛋白,结果表明PPP3CB显著抑制间质标志物Vimentin蛋白水平表达,促进上皮标志物E-cadherin蛋白表达;鬼笔环肽染色F-actin发现过表达PPP3CB有利于细胞骨架维持,沉默PPP3CB细胞骨架重组、紊乱,微丝数量显著减少;Co-IP结果显示PPP3CB与TWIST1存在相互作用,且互作区段为其催化结构域1-401;此外,PPP3CB可以调节TWIST1蛋白表达及68位丝氨酸磷酸化水平;裸鼠成瘤结果显示过表达PPP3CB显著抑制肿瘤生长。肾癌患者癌组织IHC结果表明,PPP3CB在癌旁组织中表达较Vimentin高表达的肾癌组织更高。结论:PPP3CB确实参与调控肾癌EMT、细胞迁移及肿瘤生长且其调控机制聚焦在PPP3CB与TWIST1相互作用,调节TWIST1蛋白Ser68磷酸化水平。
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