研究背景腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种严重危害人类健康的慢性血管退行性疾病,AAA可以通过瘤体破裂和出血导致患者死亡,AAA破裂后的死亡率超过80%,研究其发生及发展的机制并给予有效的治疗是减少死亡率提高预后的关键,AAA发生及发展的致病机制尚未完全了解,但AAA已被证明是多基因和多病因的疾病,这表明着可能存在几个基因组风险位点和一系列生活方式/环境风险因素协同促进疾病的发生及发展。已知涉及AAA发病的最重要几个因素如下:家族史,吸烟,年龄,高加索人种和男性。目前研究指出AAA的主要病理特征是炎症细胞浸润、细胞外基质降解、弹力纤维断裂、中膜层血管平滑肌细胞凋亡。因此,发现AAA的特异性分子及信号通路,对于进一步阐明AAA的发生发展机制,从细胞及分子机制水平调控AAA的发生和发展,为防治AAA提供新的科学依据乃至新的治疗策略,具有及其重要的基础理论和临床意义。IκB激酶复合物ε（IKKε）基因是近来被发现的IκB激酶家族中的新成员,其在炎症、肿瘤、代谢疾病中的功能和作用机制方面已取得显着进展,特别是在心肌肥厚、动脉粥样硬化也有文献报道。涉及腹主动脉瘤的分子机制虽近年来已有较多文献报道,但IKKε是否与AAA疾病的发生及进展的有关并未见相关报道。在本课题中,我们通过在载脂蛋白E缺陷(Apoe-/-)小鼠中皮下埋置血管紧张素II微量泵诱发AAA的模型,探讨测IKKε在AAA发生和发展的相关性,进一步探究IKKε在AAA形成中作用和机制。研究方法第一部分:检测标本选取自在南京市第一医院确诊为动脉瘤并接受手术患者的主动脉壁15例,与手术病例组年龄相匹配的心脏移植器官捐献者标本8例,首先用免疫组化和Western Blot检测人主动脉中IKKε的表达水平,同时应用Q-PCR对人的主动脉IKKε的mRNA表达水平进行检测。选取812周龄的雄性Apoe-/-小鼠为实验对象,将小鼠随机分为2组:Apoe-/-小鼠皮下埋置生理盐水微量泵组和血管紧张素II微量泵组。在小鼠用微量泵持续处理28天后,采用Western Blot和Q-PCR检测小鼠2周、3周、4周等不同时间点腹主动脉中IKKε的表达水平。第二部分:选取雄性Apoe–/–小鼠和Apoe-/-IKKε-/-小鼠,通过生理盐水微量泵或Ang II微量泵诱导建立AAA模型,将小鼠随机分为4组:Apoe-/-小鼠皮下埋置生理盐水微量泵组和血管紧张素II微量泵组,Apoe-/-IKKε-/-小鼠皮下埋置生理盐水微量泵组和血管紧张素II微量泵组。小鼠用微量泵持续处理28天后,观察小鼠的死亡率,并检测小鼠收缩压或血清总胆固醇;用超声检测小鼠主动脉形态;在形态学上检查,用苏木精—伊红染色法和弹力纤维染色检测小鼠主动脉管壁形态变化,弹力纤维变化。用免疫荧光和明胶酶谱分析检测小鼠主动脉的基质金属蛋白酶的表达和活性,用免疫荧光检测小鼠主动脉中巨噬细胞的浸润和炎症细胞因子的表达。用活性氧荧光探针-二氢乙啶染色检测小鼠主动脉的活性氧水平,TUNEL检测小鼠主动脉的细胞凋亡,免疫组化检测小鼠主动脉平滑肌细胞表达。第三部分:应用Western blot分别检测各组小鼠主动脉组织相关信号通路的蛋白表达情况。以NC siRNA和IKKεsiRNA转染小鼠主动脉平滑肌细胞,再分别予以PBS、血管紧张素II（1umol/L）加入培养基刺激48小时后,Western blot方法验证细胞通路机制蛋白。第四部分:在血管紧张素II微量泵诱导之前1周,用水或IKKε的选择性抑制剂Amlexanox（25mg/kg/d）每日灌胃给药直至血管紧张素II微量泵诱导结束,观察Amlexanox对血管紧张素II微量泵诱导小鼠AAA的影响。研究结果第一部分:我们发现人主动脉瘤中IKKε的表达明显高于正常主动脉对照,在小鼠中也得到了类似的结果,特别是在小鼠中IKKε的表达与血管紧张素II微量泵处理时间正相关。表明IKKε可能与腹主动脉瘤的发生和发展有关。第二部分:在小鼠用微量泵持续处理28天后,IKKε敲除并不影响血管紧张素II诱导小鼠的收缩压或血清总胆固醇。我们发现IKKε敲除显著抑制腹主动脉瘤小鼠的死亡率。在形态学上检查,在血管紧张素II微量泵诱导的小鼠腹主动脉瘤的形成过程中,我们发现IKKε敲除显著抑制了腹主动脉瘤的形成,而且明显降低了最大直径和动脉瘤的严重程度。在苏木精—伊红染色和弹力纤维染色结果中,我们还观察到IKKε敲除减轻了弹力纤维断裂和中膜层降解,用免疫荧光和明胶酶谱分析检测小鼠腹主动脉瘤的基质金属蛋白酶的表达和活性均增强,IKKε敲除减轻了这种趋势。进一步的研究发现,血管紧张素II诱导的动脉瘤中巨噬细胞的活性增强并增加了炎症细胞因子的表达,IKKε敲除减轻了这种趋势。在血管紧张素II诱导的小鼠中,IKKε敲除小鼠在动脉瘤表现出较低的活性氧水平,同时也抑制了小鼠主动脉平滑肌细胞的凋亡。第三部分:进一步研究的机制通路研究表明,通过Western Blot检测小鼠腹主动脉中的相关蛋白,Apoe-/-IKKε-/-小鼠的ERK1/2的磷酸化明显减少,表明IKKε至少是通过磷酸化ERK1/2来调控血管紧张素II诱导小鼠腹主动脉瘤形成的。Western blot检测IKKεsiRNA降低了MOVAS中IKKε的表达,Western Blot检测IKKεsiRNA血管紧张素II微量泵组小鼠主动脉平滑肌细胞的ERK1/2的磷酸化明显减少。第四部分:用Amlexanox处理的小鼠可以明显的抑制由血管紧张素II诱导AAA的发生和发展。结论我们的研究证实IKKε在血管紧张素II微量泵持续处理Apoe-/-小鼠诱发的AAA形成中所起的关键作用。IKKε可能成为AAA预防和治疗策略的一个新靶点。