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三七[Panax notogirnseng(Burk)F.H.Chen]是我国传统名贵药材,三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)是三七的主要药用成分,由多种四环三萜皂苷组成。三七对生境要求苛刻,生长周期长,制约了三七产业的可持续发展。近些年,三七的市场需求迅速扩大,而三七产量难以提高,供需矛盾突出。三七皂苷作为防治心脑血管疾病的特效天然药物,潜在市场巨大,开展三七皂苷生物合成途径研究具有重要的理论意义和实际应用价值。转录因子(Transcription factor)对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节。利用转录因子作为改造植物代谢途径的工具,以其独有的“多点调控”优势,弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的情况,而成为一种新的操作策略。目前发现的萜类合成相关的转录因子包括AP2类、WRKY类、bHLH类、锌指类和bZIP类,多集中于长春花、红豆杉、青蒿等。目前,对于三七总皂苷合成代谢途径中相关转录因子的研究还处于空白。本文利用酵母单杂交方法(Yeast One-Hybrid)和cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)从三七细胞cDNA文库中克隆到WRKY类转录因子,PnWRKY1;bHLH类转录因子,PnbHLH1,初步对其进行生物信息学分析和功能验证,为深入研究该转录因子对三七皂苷合成的转录调控奠定基础。本研究以JERE作诱饵,利用酵母单杂交的建库和筛选方法首次从三七中克隆到WRKY类转录因子基因PnWRKY1,其开放阅读框编码长度为269个氨基酸的蛋白,分子量29.5kD,等电点9.94。生物信息学分析发现此蛋白为分泌型蛋白,PnWRKY1蛋白编码区的DNA结合域与其它WRKY类转录因子的DNA结合域相比具有较高的同源性,其与西洋参中WRKY10的同源性达61%;进化树分析说明PnWRKY1可能属于WRKY Ⅱ类转录因子;三维建模结果显示PnWRKY1与拟南芥中转录因子AtWRKY1的空间结构相似度较高。体外结合的EMSA实验证明,PnWRKY1从功能上属于WRKY类转录因子,能与已知的顺式作用元件(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)相互作用,发生特异性结合。克隆出的bHLH类转录因子基因编码含有321个氨基酸的开放阅读框,分子量36.1 kD,等电点6.97。生物学信息学分析发现该蛋白属于分泌蛋白,包含67个氨基酸组成的Myc-bHLH结合域;同源性比较,进化树分析及三维建模结果可以初步推测PnbHLH1属于bHLH类转录因子。