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目的:本文通过建立H2O2诱导的神经细胞氧化损伤模型,东莨菪碱诱导的小鼠认知障碍及APP/PS1双转基因AD小鼠模型,体内外全面研究咖啡酸苯乙酯衍生物FA-97的神经保护作用及机制。方法:实验一:FA-97对H2O2诱导细胞氧化损伤模型的保护作用及机制研究。以SH-SY5Y和PC12细胞为研究对象,建立H2O2诱导的神经细胞氧化损伤模型。实验分为对照组、H202(500μ M)模型组、H2O2+FA-97低剂量组(0.25μ M)、H202+FA-97中剂量组(0.5μ M)、H2O2+FA-97高剂量组(1μ M),倒置显微镜下观察细胞形态,检测细胞LDH漏出率,CCK8实验检测细胞活力。流式细胞仪检测细胞凋亡率、Western-Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cytochrome c、Caspase-9的表达。荧光显微镜检测细胞ROS水平,试剂盒检测细胞SOD、GSH活性以及MDA、蛋白质羰基水平。核浆分离实验分离出细胞核蛋白及细胞浆蛋白,Western-Blot检测Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白表达以及Nrf2分别在细胞核和细胞浆的表达水平,激光共聚焦显微镜观察Nrf2核易位现象。荧光素酶报告基因检测Nrf2的转录活性,细胞转染Nrf2 siRNA,验证Nrf2的作用机理。实验二:FA-97对东莨菪碱诱导的学习记忆损伤小鼠学的影响及机制研究。选择18-22g的雄性昆明小鼠,一共分为8组:对照组,东莨菪碱模型组(SCOP,3mg/kg),东莨菪碱+FA-97(2.5 mg/kg)给药组,东莨菪碱+FA-97(5 mg/kg)给药组,东莨菪碱+FA-97(10 mg/kg)给药组,东莨菪碱+FA-97(10 mg/kg)给药组,东莨菪碱+多奈哌齐(DNP,3 mg/kg)阳性药组,东莨菪碱+咖啡酸苯乙酯(CAPE,10 mg/kg)给药组。FA-97、CAPE、DNP 口服给药,每日1次,连续30天。小鼠从第21天开始腹腔注射SCOP(3 mg/kg),对照组小鼠腹腔注射生理盐水。所有小鼠在注射SCOP后30min进行行为学测试。所有行为学试验结束后,于第30天处死小鼠进行标本采集。采用Morris水迷宫实验及新物体识别实验评价小鼠的学习记忆能力;尼氏染色观察小鼠海马组织CA1及CA3区神经元损伤情况;试剂盒检测小鼠海马及皮层组织中乙酰胆碱(Ach)含量,胆碱酯酶(AchE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)的活性;检测小鼠海马及皮层组织中MDA含量及其总抗氧化能力;Western-Blot及免疫组化实验检测Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达水平。实验三:FA-97对APP/PS1双转基因AD模型小鼠学习记忆功能的影响及机制研究。本研究以8月龄APP/PS1小鼠为研究对象,将其分为6组,每组12只。分组为:对照组(同窝生APP/PS1转基因阴性小鼠),模型组(APP/PS1装转基因小鼠),FA-97 低剂量组(2.5 mg/kg),FA-97 中剂量组(5 mg/kg),FA-97 高剂量组(10 mg/kg),DNP组(3 mg/kg)。FA-97、DNP 口服给药,对照组予生理盐水,每日1次,连续60天。Morris水迷宫实验,新物体识别实验及避暗实验评价小鼠学习记忆功能。酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠海马及皮层组织中Aβ1-40及Aβ1-42水平。硫磺素S(Thio s)染色检测小鼠脑组织中Aβ斑块沉积情况。尼氏染色观察小鼠海马组织CA1及CA3区神经元损伤情况。Western-Blot检测小鼠脑组织中凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Cytochrome c)以及神经突触相关蛋白(PSD95、Synapsin1、Synaptophysin、BDNF)表达。结果:实验一:FA-97对H2O2诱导细胞氧化损伤模型的保护作用及机制研究。FA-97抑制了 H2O2诱导的SH-SY5Y和PC12细胞中促氧化剂(MDA和蛋白质羰基)的水平及ROS水平,同时显著提高了几种主要抗氧化酶(SOD和GSH)的活性。FA-97能抑制H2O2诱导的神经细胞中凋亡相关蛋白的表达,抑制神经细胞凋亡,促进神经细胞活性。机制研究方面,FA-97以促进了 Nrf2的转录活性,激活下游HO-1、NQO-1的表达。实验二:FA-97对东莨菪碱诱导的记忆损伤模型小鼠学习记忆功能的影响及机制研究。水迷宫结果显示,FA-97能促进东莨菪碱诱导的记忆损伤模型小鼠逃避潜伏期,空间探索实验显示FA-97给药组小鼠穿越原平台区域的次数明显增多,新物体识别实验结果显示FA-97给药组小鼠探索新物体的时间增长。FA-97能促进经SCOP处理的小鼠海马和皮层的Ach含量和ChAT活性,抑制AchE活性;FA-97能下调SCOP处理的小鼠海马和皮层的凋亡指数Bax/Bcl-2和细胞色素c的表达。此外,FA-97能显著抑制小鼠体内丙二醛(MDA)的含量,并显著提高了 SCOP诱导的小鼠的总抗氧化能力。机制研究方面,FA-97能上调HO-1和NQO-1的表达,上调Nrf2水平,激活Nrf2/HO-1信号通路。实验三:FA-97对APP/PS1双转基因AD模型小鼠学习记忆功能的影响及机制研究。水迷宫结果显示,FA-97能促进APP/PS1小鼠逃避潜伏期,空间探索实验显示FA-97给药组小鼠穿越原平台区域的次数明显增多,新物体识别实验结果显示FA-97给药组小鼠探索新物体的时间增长,避暗实验中FA-97给药组小鼠逃避潜伏期增加。FA-97能下调APP/PS1小鼠海马及皮层组织Aβ1-40和Aβ1-42水平;FA-97能下调促凋亡蛋白Bax和细胞色素c的表达水平,促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平,FA-97 能促进 Synaptophysin、Synapsin1、PSD95 和 BDNF 的表达结论:FA-97具有显著的神经保护作用,在体外可降低H2O2诱导的细胞氧化应激水平,抑制神经元细胞凋亡,在体内可缓解东莨菪碱诱导的认知障碍,这种作用与Nrf2/HO-1信号通路被激活有关。同时FA-97能改善APP/PS1双转基因AD模型小鼠认知障碍,这种作用可能与FA-97下调脑组织中Aβ水平,保护神经突触功能以及减少神经元死亡相关。