气虚血瘀证是中医证候核心理论之一,由病久气虚,血瘀内停引起。心力衰竭（Heart failure,HF）是指由任何原因导致的心脏结构损伤或功能紊乱,引发心脏供血和供氧能力下降的综合征,久之则演化为慢性心力衰竭（Chronic heart failure,CHF）,气虚血瘀证是临床慢性心力衰竭最常见的证候之一。近年来基于质谱的蛋白质组学技术促进了蛋白分子层面疾病生物标志物的发现,虽然分析方法较多,但生物标志物的发现仍旧缓慢,因此仍需进行方法学的优化和研究。另外关于慢性睡眠剥夺复合冠状动脉结扎诱导的大鼠CHF气虚血瘀证以及复方人参补气颗粒干预的蛋白质组学研究较少。针对这些问题,本研究首先进行了血液样本蛋白质组学分析方法的比较研究,为探究蛋白分子生物标志物提供技术支撑,其次结合本实验室前期工作,建立符合临床中医证候和疾病的动物模型,并对模型和药效学进行初步评价,最后通过基于质谱的蛋白质组学技术初步探索CHF气虚血瘀证的蛋白质组学特征,并在此基础上对复方人参补气颗粒的蛋白调控机制进行初步研究。目的:比较研究血液样本的蛋白质组学分析方法,建立和优化适用于血液样本蛋白质组学分析的流程,结合本实验室工作基础建立慢性心力衰竭气虚血瘀证大鼠动物模型,完成模型评价和复方人参补气颗粒药效学评价,并采用优化的血样蛋白质组学分析方法在蛋白层面对大鼠慢性心力衰竭气虚血瘀证的病理机制和复方人参补气颗粒的治疗机制展开初步研究。方法:1血液样本蛋白质组学分析方法的比较研究采用Q-Exactive Plus质谱仪,对比分析血浆、血清和去除高丰度蛋白血清前处理方法制备的大鼠血样蛋白质组构成;比较血清样本的常规酶切、45℃孵育、热辅助酶切、二次热辅助酶切、尿素辅助酶切和变温酶切的效率;比较DDA、DIA和PRM质谱数据采集的定性定量特征;最后采用优化的方法进行大鼠血液样本蛋白质组分析,为蛋白质组学研究奠定基础。2慢性心力衰竭气虚血瘀证大鼠模型的建立和药效学评价采用左前降支冠状动脉结扎复合水平台慢性睡眠剥夺建立大鼠慢性心力衰竭气虚血瘀证模型,给药组进行复方人参补气颗粒干预,阳性药对照组进行缬沙坦灌胃给药。通过证候指标（一般状态,体重,抓力值,舌象R、G、B值,脉搏幅度）和疾病指标（心功能指标和心室重构指标、心肌组织病理形态学测定）进行模型评价和药效学评价,为蛋白质组学研究奠定基础。3慢性心力衰竭气虚血瘀证大鼠血清蛋白质组学初步研究通过非标记定量蛋白质组学技术完成大鼠血清蛋白质组的质谱分析,采用优化的血清去除高丰度蛋白、热辅助变温酶切、数据依赖性采集模式获得质谱数据,采用Proteome Discover和Maxquant软件完成RAW文件的定性定量,通过OR值（Odds ratio）对差异蛋白和相关通路进行富集初步从蛋白层面揭示病证相关的生理病理机制。结果1血液样本蛋白质组分析方法的比较研究血清样本去除高丰度蛋白后蛋白鉴定数更高、定量重复性更好;热辅助酶切和变温酶切血清样品的蛋白和肽段鉴定数以及质谱谱图匹配率相对较高,蛋白酶切效率和定性定量重复性较好;DDA操作简便,DIA重复性高,PRM定量精确;血清样本去除高丰度蛋白,采用热辅助结合变温酶切和DDA数据采集模式,三次重复试验分别鉴定到490、490、504个蛋白,鉴定总蛋白数590个,共有蛋白占比69.8%。2慢性心力衰竭气虚血瘀证大鼠模型的建立评价和药效学的初步探索2.1证候指标空白对照组大鼠毛色顺滑有光泽,反应灵敏且精神良好,大便呈黄褐色,条状;模型组大鼠毛色萎黄竖立且杂乱,眯眼且疲倦嗜睡,反应迟缓,应激反应弱。和空白对照组相比,模型组大鼠体质量降低（P<0.01）,抓力值下降,脉搏幅度显著下降（P<0.01）,舌面暗红,R、B值显著升高（P<0.01或P<0.05）,G值升高;和模型组相比,给药组体质量升高,抓力值和脉搏幅度上升,舌面R、G、B值下降（P<0.05）,阳性药对照组体质量升高,大鼠抓力值和脉搏幅度上升（P<0.05或P<0.01）,舌面R、G、B值下降。2.2疾病指标与同时期空白对照组比较,正常给药组大鼠HR降低,模型组大鼠SV,EF,FS,CO均降低（P<0.05或P<0.01）;与模型组相比,给药组的SV,EF,FS,CO均升高,阳性药对照组SV,CO均升高,各组LVM比较差异均无统计学意义。与空白对照组比较,模型组大鼠LVIDs,LVEVs,LVEVd均升高（P<0.05或P<0.01）,LVIDd升高,而LVAWs,LVAWd,LVPWs均下降（P<0.05或P<0.01）,LVPWd下降;与模型组相比,给药组的LVIDs,LVIDd,LVEVs,LVEVd均下降,而LVAWs,LVAWd均上升,阳性药对照组LVIDs,LVIDd,LVEVs,LVEVd,LVAWs,LVAWd均升高,LVPWs,LVPWd均下降,给药组和阳性药对照组变化均无统计学差异。心肌组织病理形态学观察显示,空白对照组大鼠心肌纤维排列整齐、有序、致密,心肌细胞未见变性、坏死,间质未见炎细胞浸润及纤维组织增生;模型组大鼠心肌纤维排列紊乱、无序,心肌肌束间隔增宽,心肌细胞变性肿胀,可见散在坏死,间质片状炎细胞浸润,纤维组织增生将心肌纤维分割成岛状;给药组大鼠心肌纤维排列疏松、无序,心肌细胞轻度变性,肿胀不明显,偶见坏死,间质血管扩张、充血、出血,炎细胞灶状浸润,纤维组织增生程度减轻;阳性药对照组:心肌纤维排列疏松、无序,心肌细胞肿胀较明显,偶见坏死,间质血管扩张、充血、出血,炎细胞灶状浸润,纤维组织轻度增生。取材后观察模型组肉眼可见心脏结扎部位白色水样坏死,且梗死区凹陷,部分新增肉芽组织。3慢性心力衰竭气虚血瘀证大鼠血清蛋白质组学初步研究通过非标记定量蛋白质组学获得5组的3个生物重复共15个生物样本可信度较高的526个蛋白的定量数据。设置蛋白表达差异大于两倍进行样本间差异表达蛋白（DEPs）的筛选,共发现DEPs共675个,分为422个上调蛋白和253个下调蛋白,其中56个蛋白为复方人参补气颗粒通过该蛋白调控病证相关通路,与模型相关蛋白为43个,与复方人参补气颗粒相关蛋白为20个,45个蛋白在模型状态下更易对复方人参补气颗粒产生响应,57个蛋白受药物调控也受造模调控,63个蛋白被认为参与到阳性药调控疾病的蛋白通路中,47个蛋白在给药组和阳性药对照组中发生共调。通过GO（Geno Ontology）对差异蛋白涉及的通路进行富集,共有228个差异蛋白被富集在41条生物学途径上;模型相关的生物学通路包括囊泡介导的运输,蛋白相互作用,细胞自噬,信号转导,应激反应,神经系统发育,血小板活化和凝血级联,细胞周期和有丝分裂,RNA代谢,信号转导等;造模后表达变化,经复方人参补气颗粒治疗后回调的蛋白通路均集中在免疫系统;在模型情况下对复方人参补气颗粒响应值较好的蛋白主要涉及血浆脂蛋白的组装、重塑和清除等;造模后表达变化,经阳性药治疗后回调的蛋白通路均集中在Rapl信号和整合素信号转导、MAPK通路的激活等;复方人参补气颗粒和阳性药共调节的蛋白均聚焦在免疫相关通路上。结论1比较血样蛋白质组分析方法发现,血清样本去除高丰度蛋白后,经热辅助结合变温酶切法消化,采用DDA质谱分析技术,可获得较高的鉴定蛋白覆盖率和重复性较好的定性定量结果,利用DIA和PRM技术还可对定量结果进行后续验证。基于血液样本蛋白质组分析方法的比较,建立了优化的制备和分析流程,为进一步的蛋白质组学研究创造了条件。2大鼠一般状态,体质量,抓力值,脉搏幅度和舌面R、G、B值共同提示模型组大鼠为气虚血瘀证的证型;心肌组织病理形态学和心脏形态、心功能指标和心室重构指标共同提示模型组大鼠出现明显的慢性心力衰竭状态,经复方人参补气颗粒药物干预后,各个指标均有不同程度回调。3本实验通过蛋白质组学技术,分析了空白对照组,模型组,给药组和阳性药对照组差异表达蛋白,并设计正常给药组作为参照,对差异表达蛋白进行生物信息学分析,分别富集到可能只与大鼠CHF气虚血瘀证相关蛋白,只与复方人参补气颗粒药物相关的蛋白,在CHF气虚血瘀证情况下对复方人参补气颗粒药物干预产生响应的蛋白,复方人参补气颗粒调控病证的关键蛋白和阳性药调控疾病的关键蛋白以及复方人参补气颗粒和阳性药共调控的差异蛋白。CHF气虚血瘀证富集到较多信号通路,伴随着细胞选择性自噬、血小板活化和钙离子激活、信号转导和小分子运输、细胞周期和有丝分裂、囊泡介导的运输和细胞的应激反应、蛋白代谢和翻译后修饰、基因表达和转录等生物过程;本研宄中复方人参补气颗粒干预CHF气虚血瘀证后多数疾病和证候指标发生回调但结果无显著性差异,但己明显富集到几个复方人参补气颗粒调控CHF气虚血瘀证的免疫相关通路和蛋白,包括参与细胞凋亡的Rapl信号通路和CD22介导的BCR调节,以及4个具有Ig结构域的免疫球蛋白,YWHAB基因编码的14-3-3蛋白家族和Raplb,复方人参补气颗粒可能通过这些蛋白和通路对CHF气虚血瘀证进行调控,如果延长药物干预时间,有望出现更显著的证候和疾病状态,以及相应的蛋白质组映射,为临床治疗和中医药研究提供支持。