论文部分内容阅读
在中国乳腺癌已成为威胁女性健康的头号杀手。早诊、早查、早干预是降低乳腺肿瘤发病率,降低死亡率的关键。最方便快速的方法就是检验血清中乳腺癌相关标志物。由于乳腺癌患者血清中CA15-3含量及阳性表达率显著高于良性组织,而且与组织学分级、肿瘤大小和腋窝淋巴结转移的出现呈正相关。同时,乳腺癌是一种高发恶性肿瘤,术后生存期较长,术后追踪监测CA15-3在提前发现复发、转移征兆,以便及时治疗方面具有重要的临床应用价值。目前,在体外快速诊断应用中体外检测乳腺癌血清标志物CA15-3是最为广泛常用的方法。本研究制备了乳腺癌肿瘤标志物CA15-3的单克隆抗体,并对所得单克隆抗体进行了纯度检测、效价检测、亚型鉴定与HRP标记修饰,另外利用所得抗体建立了双抗体夹心检测CA15-3体系,并对该体系进行了检测限、精密度与特异性考核,且进行了初步的临床应用。主要包括以下三个方面的内容：1.CA15-3单克隆抗体的制备。对Balb/C小鼠免疫CA15-3抗原,3次免疫之后检测小鼠抗血清效价。选择PEG作为融合剂利用杂交瘤技术将脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。经筛选获得阳性杂交瘤细胞,利用有限稀释法进一步分选出分泌单一表位抗体的杂交瘤细胞,最终获得5株阳性信号较强的杂交瘤细胞。分别为命名为#3-1-3、#5-2-2、#11-2-2、#12-1-3和#16-1-3。2.所得5株单克隆抗体的鉴定。经扩大培养后,蛋白A亲和纯化获得相应抗体。所得的5株单克隆抗体的效价在10-7～10-9(g/mL)之间,纯度在95%以上。其轻链均为K链,重链#3-1-3为IgG2a.#5-2-2与#12-1-3为IgG2b.#11-2-2与#16-1-3为IgG3。通过竞争ELISA法获得2株与#16-1-3抗体抗不同表位的单克隆抗体,分别为#11-2-2、#12-1-3。3.建立双抗体夹心检测CA15-3体系及临床应用。分别以#11-2-2与#16-1-3、#12-1-3与#16-1-3建立双抗体夹心体系。#11-2-2与#16-1-3双抗体夹心体系的线性相关系数为0.9768<0.99,且出现HD-HOOK效应：#12-1-3与#16-1-3双抗体夹心体系相关系数r为0.9928>0.99。#11-2-2mAb的效价为1.0×10-7(g/mL)；#12-1-3mAb的效价为5.4×10-8(g/mL),因此选择#12-1-3与#16-1-3双抗体夹心体系。对该体系进行检测限、精密度与特异性的考核,其灵敏度为0.59U/mL,精密度在5.6%左右,与肿瘤标志物CA19-9.CA50、CA72-4不发生交叉反应。在小样本临床试验中,对随机选取的150例乳腺癌患者及其他相关恶性癌症患者血清样本和50例健康个体血清样本进行检测,与医院临床检测结果进行对比,结果显示其Kappa=0.879>0.75,相关系数r=0.965>0.9,t-检验中,P=0.38>0.05,以上数据均说明本试验中建立的双抗体夹心检测CA15-3体系与对照试验罗氏检测具有较高的一致性和等效性。