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【背景】
天疱疮是一种少见的以表皮棘层细胞松解和表皮内水疱形成为特征的慢性自身免疫性大疱性皮肤病，典型表现为红斑基础上松弛性水疱、皮肤粘膜糜烂伴难愈污秽性结痂、皮肤Nikolsky阳性以及病理表现为表皮内棘层松解和水疱形成。
天疱疮在人群中的患病率为0.38/10万，总人口中的平均发病率为0.47/10万/年[1]。20世纪50年代初，天疱疮的死亡率平均为75％[2]。随着皮质激素的问世，天疱疮患者的死亡率下降至平均5%-10%[3]，生存质量得到显著改善。在当今中国大陆的患者的发病率基本介于世界的平均值水平。
依据临床和病理表现，天疱疮分为寻常型、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮以及增殖型天疱疮四种类型，其主要发病机制是患者存在针对角质形成细胞（keratinocyte,KC）桥粒芯蛋白（Desmoglein，Dsg）的自身抗体IgG,Dsg-IgG结合到KC后，抗原抗体复合物诱发炎症，KC分泌蛋白酶，导致桥粒破坏，棘细胞间联结解体而棘层分解，表皮内水疱形成。李惠等[4]研究发现，寻常型和副肿瘤型天疱疮患者血清孵育HaCat细胞后，Dsg-3mRNA表达较对照组上升1.5~1.8倍，但细胞表面Dsg3荧光强度均降低，研究中只是检测了mRNA的转录水平，没有检测HaCat细胞Dsg3蛋白表达差异，以及血清对HaCat细胞MMP-9的影响，研究中也没有采用Dsg单抗孵育HaCat细胞作为阳性对照，因此未能全面地了解天疱疮患者血清对HaCat细胞表达Dsg的影响，且棘层松解的详细机制尚不清。
近年发现,天疱疮的发病机制中除传统的桥粒芯(糖)蛋白自身抗体外，非桥粒芯(糖)蛋白抗体因素也参与了棘层松解的形成，为天疱疮提供了新的潜在治疗靶位[5]。基质金属蛋白酶（MMP）是一类锌离子依赖的蛋白酶超家族，参与调节细胞基质平衡。已经发现24种，其中23种发现存在于脊椎动物体内，MMP除了降解各种细胞外基质，还可激活各种非基质蛋白，包括细胞因子、趋化因子和生长因子，影响疾病的生理和病理过程[6]，MMP可由角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、炎症细胞以及肿瘤细胞等多种细胞分泌，MMP家族在结构上相似，分为6个功能区[7]：即信号肽区、前功能区、催化区、铰链区、C-末端区、跨膜区。MMP可分为6类[8]，其中MMP-9属于明胶酶类，主要降解基底膜IV型胶原。Cirillo等[9]发现MMP-9受PV血清调节，并与PV棘层松解相关。而进一步研究发现，PV中被蛋白水解的Dsg1、Dsg3以及其他重要的钙黏素可能是被某一MMP分开[10]。
寻常天疱疮(Pemphigusvulgaris,PV)是一种少见的慢性自身免疫性大疱性皮肤病，与血清中角质形成细胞（keratinocyte，KC）跨膜蛋白—桥粒芯蛋白（Desmoglein，Dsg）自身抗体有关。而Dsg主要包括Dsg1和Dsg3，Grando等[11]研究表明：Dsg3不是角质形成细胞间连接所必须的，同样，Dsg3自身抗体也不是棘层松解所必需，提示还有其他机制共同参与天疱疮的发病机制，近年，蛋白组学技术发现了天疱疮自身免疫的多种靶标，认为天疱疮发病机制存在多重攻击（multiplehit）学说[5,12]，即角质形成细胞的多种自身抗体通过与Dsg-IgG抗体协同作用导致表皮内水疱。Ca2+ATP酶基因ATP2C1（ATPasecalcium-transportingtype2Cmember1gene，ATP2C1)，编码Ca2+/Mn2+转运蛋白，该基因突变与细胞内钙稳态失调有关，是慢性家族性良性天疱疮（Hailey-Hailey）的重要病因[13,14]。Kalantari-Dehaghi等[5]研究发现，天疱疮患者血清存在ATP2C1抗体，作为一种非Dsg蛋白，ATP2C1可能参与天疱疮的发病机制。Plakophilins（PKP3）是一种桥粒斑蛋白，可以同各种细胞角蛋白结合形成中间纤维，PV-IgG诱导的细胞骨架瓦解即与PKP3和各种角蛋白结合形成中间纤维网有关。
p38MAPK是高度保守的蛋白质家族热休克蛋白的重要一员，对维持细胞膜的完整性和稳定性起重要作用，作为分子伴侣可参与调节细胞的增殖、分化及凋亡的信号转导。Mao等[15]发现，p38活化后，破坏细胞表面桥粒钙黏蛋白的定位，可能促进PV水疱形成，并认为阻断p38可成为PV的新型治疗靶点。Yazdanpanah等[16]推测p38MAPK的激活以及随后的Hsp27的磷酸化可能参与了PV的发病。SB203580是一种p38MAPK抑制剂，可阻断PKB磷酸化。
他克莫司（Tacrolimus）又名FK506，是从链霉菌属（streptomycestsukubaensis）中分离出的发酵产物，为一种强力的新型免疫抑制剂，通过与T细胞表面的免疫亲和素FK506结合蛋白（FK-BP）形成FK506/FKBP复合物，进而抑制钙调蛋白磷酸酶的活性，抑制T细胞活化和相关细胞因子表达。有报道局部应用他克莫司治疗PV患者皮肤粘膜皮损取得了良好效果[17]。Frydman等[18]报道他克莫司可以导致IL-2和IFN表达下降，并减少T淋巴细胞的活化，抑制B细胞功能，抑制anti-Dsg3IgG的产生。他克莫司对于PV的治疗有效，但关于他克莫司治疗天疱疮的直接或间接机制，却还需要更多深入研究。
【目的】
本研究通过收集2016年07月至2017年12月广州医科大学皮肤病研究所皮肤性病专科门诊确诊的寻常型天疱疮患者血清（简称PV-血清），利用HaCat细胞天疱疮细胞模型，研究PV-血清对HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录及其蛋白表达是否存在影响及如何影响，探讨P38MAPK通路是否参与Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因的转录和其蛋白表达，同时探讨他克莫司对PV-血清作用的HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因表达是否存在影响及如何影响，从而探讨天疱疮棘层松解的Dsg、非Dsg机制，以及他克莫司、P38MAPK通路在棘层松解中的作用。
【方法】
收集2016年07月至2017年12月广州医科大学皮肤病研究所皮肤性病专科门诊确诊的寻常型PV-血清。对HaCat细胞进行复苏传代。
一、第三代细胞对数生长期给予替换含5%PV-血清的DMEM高糖培养基继续培养18小时收集细胞提取总RNA进行反转录，以GADPH基因为参照，实时定量PCR（Q-PCR）检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3五个基因的Ct阈值，并计算模板量，间接反映mRNA的转录水平；WesternBlot检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；以及加入SB203580后上述四种蛋白的表达；采用直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3蛋白在不同培养基干预组别间表达差异。
二、第三代细胞对数生长期加入10μMSB203580，分别给予替换含①5%健康血清、②5%PV-血清、③Dsg3单抗、④100nmol他克莫司及5%健康血清、⑤100nmol他克莫司及5%PV-血清的DMEM高糖培养基，继续培养18小时收集细胞，提取总RNA进行反转录，以GADPH基因为参照，Q-PCR检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3五个基因的Ct阈值，并计算模板量，间接反映mRNA的转录水平；WesternBlot检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；WesternBlot检测加入SB203580后上述蛋白的表达；采用直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3在不同培养基干预组别间表达差异。
【结果】
一、5%PV-血清对HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录的影响
与正常培养组比较，5%PV血清促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因mRNA转录，cDNA模板量上升，其中Dsg1上升3.29倍、Dsg3上升3倍，MMP-9上升3倍、ATP2C1上升3.85倍、PKP3上升4倍，且均有统计学意义（p＜0.05）。与此同时，Westernblot结果显示5%PV血清促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK的蛋白表达，分别提高1.1倍、1.3倍、0.35倍、1.12倍。因此，PV-血清可以促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK的蛋白表达。
二、P38MAPK通路抑制剂对5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录的影响
加入P38MAPK通路抑制剂SB203580后，5%PV-血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP35种基因转录水平明显受到抑制，分别下降至正常培养组的1.65倍、1.57倍、1.61倍、1.56倍和1.62倍，其中Dsg1和PKP3前后比较差异有统计学意义（p＜0.1），其余3个基因差异无统计学意义（p＞0.1）。且与加入SB203580的正常培养组相比仍然上升，Dsg1上升1.81倍、Dsg3上升2.34倍，MMP-9上升1.52倍、ATP2C1上升2.11倍、PKP3上升1.81倍。提示Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录通过P38MAPK通路。对应地Westernblot结果显示：加入P38MAPK通路抑制剂SB203580后，5%PV血清组的HaCat细胞Dsg1、Dsg3、P38MAPK蛋白表达量与加入抑制剂前比较下降，分别下降54%、30%和60%，而MMP-9的蛋白表达量则出现差异，蛋白表达量上升，较前升高了26%。因此，p38MAPK抑制剂可在一定程度上抑制Dsg1、Dsg3、P38MAPK的蛋白表达，而对MMP-9的蛋白表达起促进作用。
三、他克莫司、p38MAPK抑制剂对5%PV血清组HaCat细胞Dsg、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因转录的影响
他克莫司加入5%PV血清组，HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降77%、70%、74%、74%和77%，ATP2C1的差异有统计学意义（p＜0.1），其余差异无统计学意义（p＞0.1）。与加入他克莫司的正常血清组相比较，5%PV-血清组Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1仍然分别上升17%、49%、25%倍、61%倍、15%倍，即促进转录幅度进一步缩窄。提示他克莫司在一定程度上抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录。联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后，5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降21%、39%、27%、24%和7%，Dsg3与ATP2C1的差异有统计学意义（p＜0.1），其余差异无统计学意义（p＞0.1）。与单独应用p38MAPK抑制剂的5%PV血清组相比较，联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后的5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降19%、30%、21%、86%和11%。因此，联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后可进一步抑制5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1的基因转录。他克莫司可能通过P38MAPK通路发生治疗作用，但不能排除其他通路及因素的参与。
四、直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3表达变化及细胞学改变5%PV-血清处理后，HaCat细胞表面Dsg1和Dsg3的免疫荧光强度降低，细胞连接处表达明显下调，且线状荧光被颗粒状荧光所代替，细胞间隙增宽，集落形成明显，出现细胞集落收缩，集落间分界明显。他克莫司处理后的患者血清组Dsg3荧光强度明显增强，细胞连接处表达明显升高，Dsg1荧光强度也出现轻微增强。抑制P38MAPK通路后，PV-血清组HaCat细胞连接处Dsg1表达明显下调，表现为荧光强度降低，但Dsg3表达增强，表现为荧光增强。联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后对PV-血清组Dsg1荧光强度降低，细胞连接处表达明显下调，但Dsg3继续增强，提示Dsg3对Dsg1的位阻效应，以及p38MAPK通路Dsg1、Dsg3表达中的作用有不同。
【结论】
1.PV-血清可以促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1五种基因mRNA转录，以及Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；
2、P38MAPK通路影响了Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录；抑制p38MAPK通路可以抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录；
3、他克莫司抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因的转录可能有p38MAPK通路参与；
4、直接免疫荧光可见HaCat细胞表面Dsg3对Dsg1的空间位阻效应。且Dsg3对Dsg1的影响大于Dsg3抗体对其本身抗原表达的影响。
天疱疮是一种少见的以表皮棘层细胞松解和表皮内水疱形成为特征的慢性自身免疫性大疱性皮肤病，典型表现为红斑基础上松弛性水疱、皮肤粘膜糜烂伴难愈污秽性结痂、皮肤Nikolsky阳性以及病理表现为表皮内棘层松解和水疱形成。
天疱疮在人群中的患病率为0.38/10万，总人口中的平均发病率为0.47/10万/年[1]。20世纪50年代初，天疱疮的死亡率平均为75％[2]。随着皮质激素的问世，天疱疮患者的死亡率下降至平均5%-10%[3]，生存质量得到显著改善。在当今中国大陆的患者的发病率基本介于世界的平均值水平。
依据临床和病理表现，天疱疮分为寻常型、红斑型天疱疮、落叶型天疱疮以及增殖型天疱疮四种类型，其主要发病机制是患者存在针对角质形成细胞（keratinocyte,KC）桥粒芯蛋白（Desmoglein，Dsg）的自身抗体IgG,Dsg-IgG结合到KC后，抗原抗体复合物诱发炎症，KC分泌蛋白酶，导致桥粒破坏，棘细胞间联结解体而棘层分解，表皮内水疱形成。李惠等[4]研究发现，寻常型和副肿瘤型天疱疮患者血清孵育HaCat细胞后，Dsg-3mRNA表达较对照组上升1.5~1.8倍，但细胞表面Dsg3荧光强度均降低，研究中只是检测了mRNA的转录水平，没有检测HaCat细胞Dsg3蛋白表达差异，以及血清对HaCat细胞MMP-9的影响，研究中也没有采用Dsg单抗孵育HaCat细胞作为阳性对照，因此未能全面地了解天疱疮患者血清对HaCat细胞表达Dsg的影响，且棘层松解的详细机制尚不清。
近年发现,天疱疮的发病机制中除传统的桥粒芯(糖)蛋白自身抗体外，非桥粒芯(糖)蛋白抗体因素也参与了棘层松解的形成，为天疱疮提供了新的潜在治疗靶位[5]。基质金属蛋白酶（MMP）是一类锌离子依赖的蛋白酶超家族，参与调节细胞基质平衡。已经发现24种，其中23种发现存在于脊椎动物体内，MMP除了降解各种细胞外基质，还可激活各种非基质蛋白，包括细胞因子、趋化因子和生长因子，影响疾病的生理和病理过程[6]，MMP可由角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞、炎症细胞以及肿瘤细胞等多种细胞分泌，MMP家族在结构上相似，分为6个功能区[7]：即信号肽区、前功能区、催化区、铰链区、C-末端区、跨膜区。MMP可分为6类[8]，其中MMP-9属于明胶酶类，主要降解基底膜IV型胶原。Cirillo等[9]发现MMP-9受PV血清调节，并与PV棘层松解相关。而进一步研究发现，PV中被蛋白水解的Dsg1、Dsg3以及其他重要的钙黏素可能是被某一MMP分开[10]。
寻常天疱疮(Pemphigusvulgaris,PV)是一种少见的慢性自身免疫性大疱性皮肤病，与血清中角质形成细胞（keratinocyte，KC）跨膜蛋白—桥粒芯蛋白（Desmoglein，Dsg）自身抗体有关。而Dsg主要包括Dsg1和Dsg3，Grando等[11]研究表明：Dsg3不是角质形成细胞间连接所必须的，同样，Dsg3自身抗体也不是棘层松解所必需，提示还有其他机制共同参与天疱疮的发病机制，近年，蛋白组学技术发现了天疱疮自身免疫的多种靶标，认为天疱疮发病机制存在多重攻击（multiplehit）学说[5,12]，即角质形成细胞的多种自身抗体通过与Dsg-IgG抗体协同作用导致表皮内水疱。Ca2+ATP酶基因ATP2C1（ATPasecalcium-transportingtype2Cmember1gene，ATP2C1)，编码Ca2+/Mn2+转运蛋白，该基因突变与细胞内钙稳态失调有关，是慢性家族性良性天疱疮（Hailey-Hailey）的重要病因[13,14]。Kalantari-Dehaghi等[5]研究发现，天疱疮患者血清存在ATP2C1抗体，作为一种非Dsg蛋白，ATP2C1可能参与天疱疮的发病机制。Plakophilins（PKP3）是一种桥粒斑蛋白，可以同各种细胞角蛋白结合形成中间纤维，PV-IgG诱导的细胞骨架瓦解即与PKP3和各种角蛋白结合形成中间纤维网有关。
p38MAPK是高度保守的蛋白质家族热休克蛋白的重要一员，对维持细胞膜的完整性和稳定性起重要作用，作为分子伴侣可参与调节细胞的增殖、分化及凋亡的信号转导。Mao等[15]发现，p38活化后，破坏细胞表面桥粒钙黏蛋白的定位，可能促进PV水疱形成，并认为阻断p38可成为PV的新型治疗靶点。Yazdanpanah等[16]推测p38MAPK的激活以及随后的Hsp27的磷酸化可能参与了PV的发病。SB203580是一种p38MAPK抑制剂，可阻断PKB磷酸化。
他克莫司（Tacrolimus）又名FK506，是从链霉菌属（streptomycestsukubaensis）中分离出的发酵产物，为一种强力的新型免疫抑制剂，通过与T细胞表面的免疫亲和素FK506结合蛋白（FK-BP）形成FK506/FKBP复合物，进而抑制钙调蛋白磷酸酶的活性，抑制T细胞活化和相关细胞因子表达。有报道局部应用他克莫司治疗PV患者皮肤粘膜皮损取得了良好效果[17]。Frydman等[18]报道他克莫司可以导致IL-2和IFN表达下降，并减少T淋巴细胞的活化，抑制B细胞功能，抑制anti-Dsg3IgG的产生。他克莫司对于PV的治疗有效，但关于他克莫司治疗天疱疮的直接或间接机制，却还需要更多深入研究。
【目的】
本研究通过收集2016年07月至2017年12月广州医科大学皮肤病研究所皮肤性病专科门诊确诊的寻常型天疱疮患者血清（简称PV-血清），利用HaCat细胞天疱疮细胞模型，研究PV-血清对HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录及其蛋白表达是否存在影响及如何影响，探讨P38MAPK通路是否参与Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因的转录和其蛋白表达，同时探讨他克莫司对PV-血清作用的HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因表达是否存在影响及如何影响，从而探讨天疱疮棘层松解的Dsg、非Dsg机制，以及他克莫司、P38MAPK通路在棘层松解中的作用。
【方法】
收集2016年07月至2017年12月广州医科大学皮肤病研究所皮肤性病专科门诊确诊的寻常型PV-血清。对HaCat细胞进行复苏传代。
一、第三代细胞对数生长期给予替换含5%PV-血清的DMEM高糖培养基继续培养18小时收集细胞提取总RNA进行反转录，以GADPH基因为参照，实时定量PCR（Q-PCR）检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3五个基因的Ct阈值，并计算模板量，间接反映mRNA的转录水平；WesternBlot检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；以及加入SB203580后上述四种蛋白的表达；采用直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3蛋白在不同培养基干预组别间表达差异。
二、第三代细胞对数生长期加入10μMSB203580，分别给予替换含①5%健康血清、②5%PV-血清、③Dsg3单抗、④100nmol他克莫司及5%健康血清、⑤100nmol他克莫司及5%PV-血清的DMEM高糖培养基，继续培养18小时收集细胞，提取总RNA进行反转录，以GADPH基因为参照，Q-PCR检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3五个基因的Ct阈值，并计算模板量，间接反映mRNA的转录水平；WesternBlot检测Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；WesternBlot检测加入SB203580后上述蛋白的表达；采用直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3在不同培养基干预组别间表达差异。
【结果】
一、5%PV-血清对HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录的影响
与正常培养组比较，5%PV血清促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因mRNA转录，cDNA模板量上升，其中Dsg1上升3.29倍、Dsg3上升3倍，MMP-9上升3倍、ATP2C1上升3.85倍、PKP3上升4倍，且均有统计学意义（p＜0.05）。与此同时，Westernblot结果显示5%PV血清促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK的蛋白表达，分别提高1.1倍、1.3倍、0.35倍、1.12倍。因此，PV-血清可以促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK的蛋白表达。
二、P38MAPK通路抑制剂对5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP3基因转录的影响
加入P38MAPK通路抑制剂SB203580后，5%PV-血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、ATP2C1、PKP35种基因转录水平明显受到抑制，分别下降至正常培养组的1.65倍、1.57倍、1.61倍、1.56倍和1.62倍，其中Dsg1和PKP3前后比较差异有统计学意义（p＜0.1），其余3个基因差异无统计学意义（p＞0.1）。且与加入SB203580的正常培养组相比仍然上升，Dsg1上升1.81倍、Dsg3上升2.34倍，MMP-9上升1.52倍、ATP2C1上升2.11倍、PKP3上升1.81倍。提示Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录通过P38MAPK通路。对应地Westernblot结果显示：加入P38MAPK通路抑制剂SB203580后，5%PV血清组的HaCat细胞Dsg1、Dsg3、P38MAPK蛋白表达量与加入抑制剂前比较下降，分别下降54%、30%和60%，而MMP-9的蛋白表达量则出现差异，蛋白表达量上升，较前升高了26%。因此，p38MAPK抑制剂可在一定程度上抑制Dsg1、Dsg3、P38MAPK的蛋白表达，而对MMP-9的蛋白表达起促进作用。
三、他克莫司、p38MAPK抑制剂对5%PV血清组HaCat细胞Dsg、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因转录的影响
他克莫司加入5%PV血清组，HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降77%、70%、74%、74%和77%，ATP2C1的差异有统计学意义（p＜0.1），其余差异无统计学意义（p＞0.1）。与加入他克莫司的正常血清组相比较，5%PV-血清组Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1仍然分别上升17%、49%、25%倍、61%倍、15%倍，即促进转录幅度进一步缩窄。提示他克莫司在一定程度上抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录。联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后，5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降21%、39%、27%、24%和7%，Dsg3与ATP2C1的差异有统计学意义（p＜0.1），其余差异无统计学意义（p＞0.1）。与单独应用p38MAPK抑制剂的5%PV血清组相比较，联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后的5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3及ATP2C1的基因转录分别下降19%、30%、21%、86%和11%。因此，联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后可进一步抑制5%PV血清组HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1的基因转录。他克莫司可能通过P38MAPK通路发生治疗作用，但不能排除其他通路及因素的参与。
四、直接免疫荧光检测HaCat细胞表面Dsg1、Dsg3表达变化及细胞学改变5%PV-血清处理后，HaCat细胞表面Dsg1和Dsg3的免疫荧光强度降低，细胞连接处表达明显下调，且线状荧光被颗粒状荧光所代替，细胞间隙增宽，集落形成明显，出现细胞集落收缩，集落间分界明显。他克莫司处理后的患者血清组Dsg3荧光强度明显增强，细胞连接处表达明显升高，Dsg1荧光强度也出现轻微增强。抑制P38MAPK通路后，PV-血清组HaCat细胞连接处Dsg1表达明显下调，表现为荧光强度降低，但Dsg3表达增强，表现为荧光增强。联合应用他克莫司及p38MAPK抑制剂后对PV-血清组Dsg1荧光强度降低，细胞连接处表达明显下调，但Dsg3继续增强，提示Dsg3对Dsg1的位阻效应，以及p38MAPK通路Dsg1、Dsg3表达中的作用有不同。
【结论】
1.PV-血清可以促进HaCat细胞Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1五种基因mRNA转录，以及Dsg1、Dsg3、MMP-9、P38MAPK四种蛋白表达；
2、P38MAPK通路影响了Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录；抑制p38MAPK通路可以抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因mRNA转录；
3、他克莫司抑制Dsg1、Dsg3、MMP-9、PKP3、ATP2C1基因的转录可能有p38MAPK通路参与；
4、直接免疫荧光可见HaCat细胞表面Dsg3对Dsg1的空间位阻效应。且Dsg3对Dsg1的影响大于Dsg3抗体对其本身抗原表达的影响。