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本文从以下两部分进行了阐述：
第一部分:CENPU通过FOXM1调控肺癌细胞增殖的研究
背景:
着丝粒蛋白U（Centromere protein U，CENPU），也称为骨髓增生异常/骨髓性白血病因子1相互作用的蛋白(Myelodysplasia/acute myeloid leukemia factor1 interatingprotein，MLF1 IP)、卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏性核抗原相互作用蛋白1(Kaposissarcoma-associated herpesvirus-latent nuclear antigen interacting protein1,KL1P1),Cenp-50或Polo盒相互作用蛋白1(polo-box-interacting protein1，PBIP1)，是着丝粒的组成性成分，在调控有丝分裂进程中发挥重要作用。据报道，CENPU可以抑制单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子活性，而在卵巢癌细胞中，CENPU可调控HMGB2的表达从而促进肿瘤细胞增殖，这意味着CENPU具有抑制或促进基因转录的功能。新近研究表明，CENPU在胶质瘤细胞中高表达，并通过抑制胶质瘤细胞的凋亡促进胶质瘤的生长;在乳腺癌中，CENPU的过表达与乳腺癌的进展和不良预后相关，而在前列腺癌中，CENPU的表达呈现出较大的个体差异。然而，目前有关CENPU在NSCLC中的表达及作用机制、CENPU的表达与患者预后之间的关系尚不清楚。深入研究CENPU在NSCLC中的表达及作用有利于发掘新的肺癌治疗靶点，为提高肺癌患者的临床预后提供新策略。
方法:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织和正常肺组织中的表达。
(1)采用在线数据库UALCAN分析NSCLC患者肺癌组织及正常肺组织中CENPU的表达情况。
(2)收集手术切除的NSCLC患者肺癌组织和正常肺组织。
(3)采用qRT-PCR及Western blot的方法检测NSCLC患者肺癌组织及正常肺组织中CENPU的mRNA和蛋白表达水平。
2.CENPU与NSCLC患者预后的关系。
(1)采用在线数据库PROGgeneV2和Kaplan Meier-plotter分析CENPU的表达水平与NSCLC患者预后的关系。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
(1)采用siRNA技术敲降肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)采用CCK-8、EdU染色检测敲降CENPU的表达对肺癌细胞增殖能力的影响。
(3)通过PI染色检测敲降CENPU的表达对肺癌细胞细胞周期的影响。
4.外源性过表达肺癌细胞中的CENPU可促进其增殖能力。
(1)通过转染CENPU表达质粒外源性过表达肺癌细胞中的CENPU。
(2)采用EdU染色检测过表达CENPU对肺癌细胞增殖能力的影响。
5.CENPU可调控肺癌细胞中转录分子FOXM1的表达。
6.敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
7.FOXM1过表达预示NSCLC癌患者的不良预后。
采用在线数据库PROGgeneV2和Kaplan Meier-plotter分析FOXM1的表达与NSCLC患者预后的关系。
结果:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织中过表达。
(1)在线数据库分析结果显示，CENPU在NSCLC患者肺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织。
(2)qRT-PCR及Western blot检测结果显示NSCLC患者肺癌组织中CENPU的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常肺组织，与在线数据库分析结果一致。
2.过表达CENPU提示NSCLC患者不良预后。
在线数据库分析结果显示CENPU高表达组NSCLC患者的OS和的RFS较低表达组明显缩短。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
(1)qRT-PCR及Western blot技术验证转染siCENPU可有效敲降肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)CCK-8及EdU检测结果显示，敲降肺癌细胞CENPU的表达可显著抑制肺癌细胞增殖。
(3)敲降肺癌细胞CENPU的表达可引起G1-M期阻滞。
4.外源性过表达肺癌细胞中的CENPU可促进其增殖。
(1)转染CENPU表达质粒可成功上调肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)EdU染色结果显示，过表达CENPU可促进肺癌细胞的增殖。
5.CENPU可调控肺癌细胞中转录分子FOXM1的表达。
(1)在线数据库分析结果显示，在肺癌组织中CENPU与FOXM1的表达呈正相关。
(2)qRT-PCR及Western blot结果显示，敲降肺癌细胞中CENPU的表达可明显下调FOXM1的表达。
(3)qRT-PCR及Western blot结果显示，敲降肺癌细胞中FOXM1的表达并不影响CENPU的表达。
(4)EdU检测结果显示，过表达FOXM1可逆转CENPU敲降所导致的肺癌细胞增殖受抑。
6.敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
(1)在线数据库分析发现，FOXM1的表达与增殖指标PCNA及Ki-67的表达呈正相关。
(2)qRT-PCR及Western blot验证siFOXM1可有效敲降肺癌细胞中FOXM1的表达。
(3)EdU检测结果显示敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
(4)PI染色结果显示敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞细胞周期的进程。
7.FOXM1过表达预示肺癌患者不良预后
在线数据库分析结果提示FOXM1高表达组患者的OS较低表达组明显缩短。
结论:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织中的表达水平显著高于正常肺组织。
2.过表达CENPU提示肺癌患者的不良预后。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞增殖.
4.CENPU通过调控转录分子FOXM1的表达促进肺癌细胞的增殖。
5.敲降肺癌细胞中FOXM1的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
6.过表达FOXM1提示肺癌患者的不良预后。
第二部分:CD45+红系前体细胞免疫抑制功能的研究
背景:
晚期恶性肿瘤患者普遍表现出免疫功能低下状态，易出现病毒或细菌感染，且常常合并贫血。恶性肿瘤合并贫血是否是导致机体免疫功能受损的原因呢？本课题组前期研究发现，晚期荷瘤小鼠合并贫血可诱导脾脏髓外造血，产生一群CD45+Ter119+CD71+的红系前体细胞（Erythroid progenitor cell，EPC）。这群CD45+ EPCs约占脾脏有核细胞的15-20％，但具体功能和作用机制尚不清楚。本研究将着重阐明这群细胞的生物学功能及其作用机制，以期为发掘新的抗肿瘤免疫治疗手段开辟新途径。
方法:
1.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC对CD8+T细胞增殖能力的影响。
(1)在LLC荷瘤后第21天及MMTV-PyMT自发性乳腺癌小鼠20周龄时，采用流式分选小鼠脾脏CD45+ EPC。
(2)磁珠分选na(i)ve C57小鼠脾脏CD8+T细胞，标记CFSE。
(3)体外共培养CD45+ EPC及CD8+T细胞。
(4)共培养3天后流式检测CD8+T细胞的增殖情况。
2.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC对抗原特异性CD8+T细胞杀伤功能的影响。
(1)流式分选晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC。
(2)分选LCMV-CL13感染后第8天脾脏抗原特异性CD8+T细胞。
(3)将CD45+ EPC与抗原特异性CD8+T细胞混合后与包被抗原肽的靶细胞共培养。
(4)流式检测抗原特异性CD8+T细胞杀伤能力的变化。
3.分选晚期荷瘤合并贫血小鼠、药物诱导贫血小鼠及新生小鼠脾脏CD45+ EPC进行RNAseq检测及分析。
(1)分别分选晚期荷瘤合并贫血小鼠、药物诱导贫血小鼠及新生小鼠脾脏CD45+ EPC，分选荷瘤小鼠脾脏MDSC做为参照。
(2)RNAseq检测及数据分析。
4.检测CD45+ EPC合成ROS的能力。
5.阻断ROS通路对晚期荷瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+Ter119+CD71+红系前体细胞免疫抑制功能的影响。
结果:
1.晚期肿瘤并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC可显著抑制CD8+T细胞增殖能力。
2.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC可显著抑制抗原特异性CD8+T细胞的杀伤功能。
3.RNAseq结果显示晚期荷瘤小鼠来源的CD45+ EPC与脾脏MDSC具有相似的基因转录组。
4.阻断ROS通路可抑制CD45+ EPC的免疫抑制功能。
结论:
1.CD45+ EPC具有抑制CD8+T细胞增殖和杀伤能力的功能。
2.产生过量的ROS是CD45+ EPC介导的CD8+T细胞免疫抑制的主要机制。
第一部分:CENPU通过FOXM1调控肺癌细胞增殖的研究
背景:
着丝粒蛋白U（Centromere protein U，CENPU），也称为骨髓增生异常/骨髓性白血病因子1相互作用的蛋白(Myelodysplasia/acute myeloid leukemia factor1 interatingprotein，MLF1 IP)、卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏性核抗原相互作用蛋白1(Kaposissarcoma-associated herpesvirus-latent nuclear antigen interacting protein1,KL1P1),Cenp-50或Polo盒相互作用蛋白1(polo-box-interacting protein1，PBIP1)，是着丝粒的组成性成分，在调控有丝分裂进程中发挥重要作用。据报道，CENPU可以抑制单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子活性，而在卵巢癌细胞中，CENPU可调控HMGB2的表达从而促进肿瘤细胞增殖，这意味着CENPU具有抑制或促进基因转录的功能。新近研究表明，CENPU在胶质瘤细胞中高表达，并通过抑制胶质瘤细胞的凋亡促进胶质瘤的生长;在乳腺癌中，CENPU的过表达与乳腺癌的进展和不良预后相关，而在前列腺癌中，CENPU的表达呈现出较大的个体差异。然而，目前有关CENPU在NSCLC中的表达及作用机制、CENPU的表达与患者预后之间的关系尚不清楚。深入研究CENPU在NSCLC中的表达及作用有利于发掘新的肺癌治疗靶点，为提高肺癌患者的临床预后提供新策略。
方法:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织和正常肺组织中的表达。
(1)采用在线数据库UALCAN分析NSCLC患者肺癌组织及正常肺组织中CENPU的表达情况。
(2)收集手术切除的NSCLC患者肺癌组织和正常肺组织。
(3)采用qRT-PCR及Western blot的方法检测NSCLC患者肺癌组织及正常肺组织中CENPU的mRNA和蛋白表达水平。
2.CENPU与NSCLC患者预后的关系。
(1)采用在线数据库PROGgeneV2和Kaplan Meier-plotter分析CENPU的表达水平与NSCLC患者预后的关系。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
(1)采用siRNA技术敲降肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)采用CCK-8、EdU染色检测敲降CENPU的表达对肺癌细胞增殖能力的影响。
(3)通过PI染色检测敲降CENPU的表达对肺癌细胞细胞周期的影响。
4.外源性过表达肺癌细胞中的CENPU可促进其增殖能力。
(1)通过转染CENPU表达质粒外源性过表达肺癌细胞中的CENPU。
(2)采用EdU染色检测过表达CENPU对肺癌细胞增殖能力的影响。
5.CENPU可调控肺癌细胞中转录分子FOXM1的表达。
6.敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
7.FOXM1过表达预示NSCLC癌患者的不良预后。
采用在线数据库PROGgeneV2和Kaplan Meier-plotter分析FOXM1的表达与NSCLC患者预后的关系。
结果:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织中过表达。
(1)在线数据库分析结果显示，CENPU在NSCLC患者肺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织。
(2)qRT-PCR及Western blot检测结果显示NSCLC患者肺癌组织中CENPU的mRNA和蛋白表达水平均显著高于正常肺组织，与在线数据库分析结果一致。
2.过表达CENPU提示NSCLC患者不良预后。
在线数据库分析结果显示CENPU高表达组NSCLC患者的OS和的RFS较低表达组明显缩短。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
(1)qRT-PCR及Western blot技术验证转染siCENPU可有效敲降肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)CCK-8及EdU检测结果显示，敲降肺癌细胞CENPU的表达可显著抑制肺癌细胞增殖。
(3)敲降肺癌细胞CENPU的表达可引起G1-M期阻滞。
4.外源性过表达肺癌细胞中的CENPU可促进其增殖。
(1)转染CENPU表达质粒可成功上调肺癌细胞中CENPU的表达。
(2)EdU染色结果显示，过表达CENPU可促进肺癌细胞的增殖。
5.CENPU可调控肺癌细胞中转录分子FOXM1的表达。
(1)在线数据库分析结果显示，在肺癌组织中CENPU与FOXM1的表达呈正相关。
(2)qRT-PCR及Western blot结果显示，敲降肺癌细胞中CENPU的表达可明显下调FOXM1的表达。
(3)qRT-PCR及Western blot结果显示，敲降肺癌细胞中FOXM1的表达并不影响CENPU的表达。
(4)EdU检测结果显示，过表达FOXM1可逆转CENPU敲降所导致的肺癌细胞增殖受抑。
6.敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
(1)在线数据库分析发现，FOXM1的表达与增殖指标PCNA及Ki-67的表达呈正相关。
(2)qRT-PCR及Western blot验证siFOXM1可有效敲降肺癌细胞中FOXM1的表达。
(3)EdU检测结果显示敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞增殖。
(4)PI染色结果显示敲降FOXM1的表达可抑制肺癌细胞细胞周期的进程。
7.FOXM1过表达预示肺癌患者不良预后
在线数据库分析结果提示FOXM1高表达组患者的OS较低表达组明显缩短。
结论:
1.CENPU在NSCLC患者肺癌组织中的表达水平显著高于正常肺组织。
2.过表达CENPU提示肺癌患者的不良预后。
3.敲降肺癌细胞中CENPU的表达可抑制肺癌细胞增殖.
4.CENPU通过调控转录分子FOXM1的表达促进肺癌细胞的增殖。
5.敲降肺癌细胞中FOXM1的表达可抑制肺癌细胞的增殖。
6.过表达FOXM1提示肺癌患者的不良预后。
第二部分:CD45+红系前体细胞免疫抑制功能的研究
背景:
晚期恶性肿瘤患者普遍表现出免疫功能低下状态，易出现病毒或细菌感染，且常常合并贫血。恶性肿瘤合并贫血是否是导致机体免疫功能受损的原因呢？本课题组前期研究发现，晚期荷瘤小鼠合并贫血可诱导脾脏髓外造血，产生一群CD45+Ter119+CD71+的红系前体细胞（Erythroid progenitor cell，EPC）。这群CD45+ EPCs约占脾脏有核细胞的15-20％，但具体功能和作用机制尚不清楚。本研究将着重阐明这群细胞的生物学功能及其作用机制，以期为发掘新的抗肿瘤免疫治疗手段开辟新途径。
方法:
1.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC对CD8+T细胞增殖能力的影响。
(1)在LLC荷瘤后第21天及MMTV-PyMT自发性乳腺癌小鼠20周龄时，采用流式分选小鼠脾脏CD45+ EPC。
(2)磁珠分选na(i)ve C57小鼠脾脏CD8+T细胞，标记CFSE。
(3)体外共培养CD45+ EPC及CD8+T细胞。
(4)共培养3天后流式检测CD8+T细胞的增殖情况。
2.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC对抗原特异性CD8+T细胞杀伤功能的影响。
(1)流式分选晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC。
(2)分选LCMV-CL13感染后第8天脾脏抗原特异性CD8+T细胞。
(3)将CD45+ EPC与抗原特异性CD8+T细胞混合后与包被抗原肽的靶细胞共培养。
(4)流式检测抗原特异性CD8+T细胞杀伤能力的变化。
3.分选晚期荷瘤合并贫血小鼠、药物诱导贫血小鼠及新生小鼠脾脏CD45+ EPC进行RNAseq检测及分析。
(1)分别分选晚期荷瘤合并贫血小鼠、药物诱导贫血小鼠及新生小鼠脾脏CD45+ EPC，分选荷瘤小鼠脾脏MDSC做为参照。
(2)RNAseq检测及数据分析。
4.检测CD45+ EPC合成ROS的能力。
5.阻断ROS通路对晚期荷瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+Ter119+CD71+红系前体细胞免疫抑制功能的影响。
结果:
1.晚期肿瘤并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC可显著抑制CD8+T细胞增殖能力。
2.晚期肿瘤合并贫血小鼠脾脏CD45+ EPC可显著抑制抗原特异性CD8+T细胞的杀伤功能。
3.RNAseq结果显示晚期荷瘤小鼠来源的CD45+ EPC与脾脏MDSC具有相似的基因转录组。
4.阻断ROS通路可抑制CD45+ EPC的免疫抑制功能。
结论:
1.CD45+ EPC具有抑制CD8+T细胞增殖和杀伤能力的功能。
2.产生过量的ROS是CD45+ EPC介导的CD8+T细胞免疫抑制的主要机制。