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目的:
结直肠癌(colorectal caner，CRC)是最常见的消化系统恶性肿瘤。2018年CA Cancer J Clin公布数据显示其发病率和死亡率均位居全球所有肿瘤第三位[1]，晚期结直肠癌患者的5年生存期不到10％[2]，阐明其发病机制降低发病率和探寻有效治疗方案降低死亡率是亟待解决的科学问题。结直肠癌微环境中浸润大量的免疫细胞，其中髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)介导的免疫耐受是促进结直肠癌进展，导致免疫治疗失败的重要原因之一[3-5,23]。因此研究MDSC的促癌机制为CRC的免疫治疗提供新的策略。
炎症诱导的程序性坏死与caspases介导凋亡，以及NF-κB介导的增殖途径平行互补，相互制衡[6]。受体相互作用蛋白激酶3(Receptor interacting protein kinase，RIPK3)是细胞程序性坏死的关键调控分子[7]，但它在肿瘤免疫中的作用仍不明确。已有研究报道RIPK3可以促进IBD的肠道粘膜修复[8]。更重要的是，RIPK3可以抑制肠癌的形成，并显著抑制肠道组织中S100A9、IL-1β、IL-11、IL-6、TNF-a、CXCL-1、CXCL-2等促炎因子的产生[9]。而上述这些炎症因子据报道恰恰可以明显促进MDSCs的增殖和免疫抑制功能[10]。因此，RIPK3可能通过调控肿瘤微环境中的MDSC浸润而影响结直肠癌的形成。
方法:
1.结直肠癌微环境MDSC中RIPK3的表达
2.RIPK3缺失对结直肠癌形成和MDSC浸润的影响
3.RIPK3缺失对MDSC的增殖活性和免疫抑制功能的影响
4.RIPK3缺失的MDSC对结直肠癌形成的影响
5.RIPK3缺失激活MDSC免疫抑制的机制
6.阻断PGE2的合成和作用对结直肠癌发生的影响
7.RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生
结果:
1.肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达水平下调:
1.1采用AOM-DSS诱导方法成功构建WT小鼠自发性结直肠癌模型;
1.2肿瘤组织中白细胞、MDSC和Mφ浸润增加，CD8+T cells和DC浸润减少;
1.3肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达下调。
1.4临床结直肠癌组织中MDSC浸润增加，MDSC上RIPK3表达下降。
1.5肠道MDSC上RIPK3的表达水平在IBD阶段升高，至CRC阶段则下调。
1.6肿瘤组织中CD45+T cells，Mφ，DC，Treg，CD4+T cells，CD8+T cells上RIPK3的表达水平无显著改变。
1.7肿瘤上清刺激WT-BMC后，MDSC比例显著上升，而MDSC上RIPK3表达下调。
2.RIPK3缺失促进结直肠癌形成和MDSC的浸润
2.1成功构建WT和KO小鼠结直肠癌模型;
2.2KO组的小鼠体重下降更显著，便血程度加重，生存率更差;成瘤数量更多，肠道长度更短，脾脏更重;脾脏，肠道和肿瘤组织中MDSC浸润增加;
2.3KO组的小鼠肿瘤组织中CD45+cells和粒系MDSC浸润增多，而Mφ，DC，Treg，CD4+T cells，CD8+T cells浸润比例无显著变化;
2.4成功构建GSK872抑制剂和WT小鼠结直肠癌模型;
2.5GSK872组小鼠体重下降更显著，肠道更短，脾脏更重，肿瘤成瘤更多，肠道组织中MDSC浸润增加，而Mφ，DC无显著改变。
3.体外实验RIPK3缺失促进MDSC的增殖活化和免疫抑制功能。
3.1.KO-BMC经肿瘤上清刺激后，MDSC比例更高，
3.2.KO-MDSC增殖能力略增强;
3.3.KO-MDSC的凋亡坏死无改变;
3.4.KO-MDSC向巨噬细胞，尤其是M2分化增加，向DC细胞分化减弱;
3.5.KO-MDSC表达更高水平的Arg-1，而不是ROS和iNOS;
3.6.KO-MDSC显著抑制CD8+Tcells的GzmB and IFN-γ表达水平。
3.7.KO-MDSC显著抑制CD8+Tcells的增殖能力。
3.8.Arg-1抑制剂NHNL可以抑制MDSC的免疫抑制功能。
3.9.KO-MDSC培养上清显著增强CT-26的增殖能力。
4.RIPK3缺失的骨髓细胞BMC和MDSC显著促进结直肠癌的形成。
4.1成功构建小鼠体内辐照嵌合回输结直肠癌模型:KO→WT组体重下降最明显，致死率最高;KO→WT组成瘤率最高，肠道最短，脾脏最大;脾脏和肠道组织中MDSC和粒系MDSC浸润显著增加;巨噬细胞和DC浸润无显著改变;
4.2.成功构建KO小鼠体内MDSC清除结直肠癌模型:MDSC清除组小鼠体重下降明显减轻，致死率下降;肠道更长，肿瘤形成数量显著减少;脾脏和肠道组织中MDSC浸润显著减少。
4.3.成功构建KO小鼠体内抑制MDSC趋化结直肠癌模型:抑制MDSC趋化组小鼠体重下降明显减轻，致死率下降;肠道更长，肿瘤形成数量显著减少;脾脏和肠道组织中MDSC浸润显著减少。
5.RIPK3缺失激活MDSC内NF-κB/COX-2/PGE2信号通路。
5.1.KO小鼠肿瘤和肠道组织中MDSC浸润增加，COX-2表达增加;
5.2.KO小鼠肿瘤组织中MDSC上COX-2表达水平增强;
5.3.超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测发现KO-MDSC分泌更多的PGE2;
5.4.KO-MDSC上PGE2受体EP2和EP4基因水平表达更高;
5.5.KO-MDSC的p65和COX-2表达水平更高;
5.6.KO-MDSC的STAT3和STAT6表达及磷酸化水平无显著改变;
5.7.KO小鼠肠道和肿瘤组织中CD45-细胞中COX-2表达水平增强。
6.阻断COX-2和PGE2受体EP2抑制MDSC的免疫抑制功能，并促进结直肠癌的形成
6.1体外实验
6.1.1PGE2促进MDSC上Arg-1的表达;
6.1.2ASA和AH6809抑制KO-MDSC上Arg-1的表达;
6.1.3PGE2促进MDSC向M2分化;
6.1.4ASA和AH6809抑制KO-MDSC向M2分化;
6.1.5ASA、CAPE、AH6809显著减弱KO-MDSC的免疫抑制能力;
6.1.6ASA和CAPE显著抑制KO-MDSC分泌PGE2。
6.1.7GSK872促进CT-26细胞分泌更多的PGE2。
6.2体内实验
6.2.1成功构建KO小鼠体内ASA、AH6809、ONO-AE3-204抑制剂治疗结直肠癌模型;
6.2.2ASA组和AH6809组小鼠的体重下降减轻，而ONO-AE3-204组没有显著差异;
6.2.3ASA组和AH6809组小鼠的肠道更长，肠道成瘤减少;
6.2.4ASA组小鼠脾脏，肠道和肿瘤组织中MDSC和粒系MDSC浸润减少，MDSC上COX-2表达下调;
6.2.5AH6809组小鼠脾脏，肠道组织中MDSC和粒系MDSC浸润减少。
7.PGE2通过激活PKA-CREB轴负调控RIPK3，形成RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生。
7.1.PGE2可以抑制MDSC上RIPK3的蛋白表达水平;促进p65和COX-2的蛋白表达水平;
7.2.ASA可以抑制MDSC上RIPK3的表达水平;
7.3.PGE2抑制RIPK3的基因表达水平，H89和AH6809逆转了RIPK3的表达;
7.4.PGE2促进MDSC上PKA-CREB的蛋白表达水平，H89和AH6809逆转了PKA-CREB的表达;
7.5.在CT-26细胞中，Western-blot检测结果显示PGE2激活PKA-CREB通路，抑制RIPK3表达;GSK872促进CT-26表达p65和COX-2;
7.6.伴随结直肠癌分期越晚，肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达越低。
7.7.GSE21510显示RIPK3和MDSC的标志物CD33，S100A8负相关，与PTGS2负相关。
7.8.GSE17536显示RIPK3高表达和COX-2低表达组的患者群体生存期更长。
结论:
1.结直肠癌形成过程中，肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达水平下调。
2.RIPK3缺失促进结直肠癌形成和MDSC的浸润。
3.RIPK3缺失促进MDSC的增殖活性和免疫抑制功能。
4.RIPK3缺失的骨髓细胞和MDSC显著促进结直肠癌的形成。
5.RIPK3缺失激活MDSC内NF-κB/COX-2/PGE2信号通路。
6.阻断COX-2和PGE2受体EP2抑制MDSC的免疫抑制功能，并促进结直肠癌的形成。
7.PGE2通过激活PKA-CREB轴负调控RIPK3，形成RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生。
结直肠癌(colorectal caner，CRC)是最常见的消化系统恶性肿瘤。2018年CA Cancer J Clin公布数据显示其发病率和死亡率均位居全球所有肿瘤第三位[1]，晚期结直肠癌患者的5年生存期不到10％[2]，阐明其发病机制降低发病率和探寻有效治疗方案降低死亡率是亟待解决的科学问题。结直肠癌微环境中浸润大量的免疫细胞，其中髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)介导的免疫耐受是促进结直肠癌进展，导致免疫治疗失败的重要原因之一[3-5,23]。因此研究MDSC的促癌机制为CRC的免疫治疗提供新的策略。
炎症诱导的程序性坏死与caspases介导凋亡，以及NF-κB介导的增殖途径平行互补，相互制衡[6]。受体相互作用蛋白激酶3(Receptor interacting protein kinase，RIPK3)是细胞程序性坏死的关键调控分子[7]，但它在肿瘤免疫中的作用仍不明确。已有研究报道RIPK3可以促进IBD的肠道粘膜修复[8]。更重要的是，RIPK3可以抑制肠癌的形成，并显著抑制肠道组织中S100A9、IL-1β、IL-11、IL-6、TNF-a、CXCL-1、CXCL-2等促炎因子的产生[9]。而上述这些炎症因子据报道恰恰可以明显促进MDSCs的增殖和免疫抑制功能[10]。因此，RIPK3可能通过调控肿瘤微环境中的MDSC浸润而影响结直肠癌的形成。
方法:
1.结直肠癌微环境MDSC中RIPK3的表达
2.RIPK3缺失对结直肠癌形成和MDSC浸润的影响
3.RIPK3缺失对MDSC的增殖活性和免疫抑制功能的影响
4.RIPK3缺失的MDSC对结直肠癌形成的影响
5.RIPK3缺失激活MDSC免疫抑制的机制
6.阻断PGE2的合成和作用对结直肠癌发生的影响
7.RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生
结果:
1.肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达水平下调:
1.1采用AOM-DSS诱导方法成功构建WT小鼠自发性结直肠癌模型;
1.2肿瘤组织中白细胞、MDSC和Mφ浸润增加，CD8+T cells和DC浸润减少;
1.3肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达下调。
1.4临床结直肠癌组织中MDSC浸润增加，MDSC上RIPK3表达下降。
1.5肠道MDSC上RIPK3的表达水平在IBD阶段升高，至CRC阶段则下调。
1.6肿瘤组织中CD45+T cells，Mφ，DC，Treg，CD4+T cells，CD8+T cells上RIPK3的表达水平无显著改变。
1.7肿瘤上清刺激WT-BMC后，MDSC比例显著上升，而MDSC上RIPK3表达下调。
2.RIPK3缺失促进结直肠癌形成和MDSC的浸润
2.1成功构建WT和KO小鼠结直肠癌模型;
2.2KO组的小鼠体重下降更显著，便血程度加重，生存率更差;成瘤数量更多，肠道长度更短，脾脏更重;脾脏，肠道和肿瘤组织中MDSC浸润增加;
2.3KO组的小鼠肿瘤组织中CD45+cells和粒系MDSC浸润增多，而Mφ，DC，Treg，CD4+T cells，CD8+T cells浸润比例无显著变化;
2.4成功构建GSK872抑制剂和WT小鼠结直肠癌模型;
2.5GSK872组小鼠体重下降更显著，肠道更短，脾脏更重，肿瘤成瘤更多，肠道组织中MDSC浸润增加，而Mφ，DC无显著改变。
3.体外实验RIPK3缺失促进MDSC的增殖活化和免疫抑制功能。
3.1.KO-BMC经肿瘤上清刺激后，MDSC比例更高，
3.2.KO-MDSC增殖能力略增强;
3.3.KO-MDSC的凋亡坏死无改变;
3.4.KO-MDSC向巨噬细胞，尤其是M2分化增加，向DC细胞分化减弱;
3.5.KO-MDSC表达更高水平的Arg-1，而不是ROS和iNOS;
3.6.KO-MDSC显著抑制CD8+Tcells的GzmB and IFN-γ表达水平。
3.7.KO-MDSC显著抑制CD8+Tcells的增殖能力。
3.8.Arg-1抑制剂NHNL可以抑制MDSC的免疫抑制功能。
3.9.KO-MDSC培养上清显著增强CT-26的增殖能力。
4.RIPK3缺失的骨髓细胞BMC和MDSC显著促进结直肠癌的形成。
4.1成功构建小鼠体内辐照嵌合回输结直肠癌模型:KO→WT组体重下降最明显，致死率最高;KO→WT组成瘤率最高，肠道最短，脾脏最大;脾脏和肠道组织中MDSC和粒系MDSC浸润显著增加;巨噬细胞和DC浸润无显著改变;
4.2.成功构建KO小鼠体内MDSC清除结直肠癌模型:MDSC清除组小鼠体重下降明显减轻，致死率下降;肠道更长，肿瘤形成数量显著减少;脾脏和肠道组织中MDSC浸润显著减少。
4.3.成功构建KO小鼠体内抑制MDSC趋化结直肠癌模型:抑制MDSC趋化组小鼠体重下降明显减轻，致死率下降;肠道更长，肿瘤形成数量显著减少;脾脏和肠道组织中MDSC浸润显著减少。
5.RIPK3缺失激活MDSC内NF-κB/COX-2/PGE2信号通路。
5.1.KO小鼠肿瘤和肠道组织中MDSC浸润增加，COX-2表达增加;
5.2.KO小鼠肿瘤组织中MDSC上COX-2表达水平增强;
5.3.超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)检测发现KO-MDSC分泌更多的PGE2;
5.4.KO-MDSC上PGE2受体EP2和EP4基因水平表达更高;
5.5.KO-MDSC的p65和COX-2表达水平更高;
5.6.KO-MDSC的STAT3和STAT6表达及磷酸化水平无显著改变;
5.7.KO小鼠肠道和肿瘤组织中CD45-细胞中COX-2表达水平增强。
6.阻断COX-2和PGE2受体EP2抑制MDSC的免疫抑制功能，并促进结直肠癌的形成
6.1体外实验
6.1.1PGE2促进MDSC上Arg-1的表达;
6.1.2ASA和AH6809抑制KO-MDSC上Arg-1的表达;
6.1.3PGE2促进MDSC向M2分化;
6.1.4ASA和AH6809抑制KO-MDSC向M2分化;
6.1.5ASA、CAPE、AH6809显著减弱KO-MDSC的免疫抑制能力;
6.1.6ASA和CAPE显著抑制KO-MDSC分泌PGE2。
6.1.7GSK872促进CT-26细胞分泌更多的PGE2。
6.2体内实验
6.2.1成功构建KO小鼠体内ASA、AH6809、ONO-AE3-204抑制剂治疗结直肠癌模型;
6.2.2ASA组和AH6809组小鼠的体重下降减轻，而ONO-AE3-204组没有显著差异;
6.2.3ASA组和AH6809组小鼠的肠道更长，肠道成瘤减少;
6.2.4ASA组小鼠脾脏，肠道和肿瘤组织中MDSC和粒系MDSC浸润减少，MDSC上COX-2表达下调;
6.2.5AH6809组小鼠脾脏，肠道组织中MDSC和粒系MDSC浸润减少。
7.PGE2通过激活PKA-CREB轴负调控RIPK3，形成RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生。
7.1.PGE2可以抑制MDSC上RIPK3的蛋白表达水平;促进p65和COX-2的蛋白表达水平;
7.2.ASA可以抑制MDSC上RIPK3的表达水平;
7.3.PGE2抑制RIPK3的基因表达水平，H89和AH6809逆转了RIPK3的表达;
7.4.PGE2促进MDSC上PKA-CREB的蛋白表达水平，H89和AH6809逆转了PKA-CREB的表达;
7.5.在CT-26细胞中，Western-blot检测结果显示PGE2激活PKA-CREB通路，抑制RIPK3表达;GSK872促进CT-26表达p65和COX-2;
7.6.伴随结直肠癌分期越晚，肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达越低。
7.7.GSE21510显示RIPK3和MDSC的标志物CD33，S100A8负相关，与PTGS2负相关。
7.8.GSE17536显示RIPK3高表达和COX-2低表达组的患者群体生存期更长。
结论:
1.结直肠癌形成过程中，肿瘤微环境中MDSC上RIPK3表达水平下调。
2.RIPK3缺失促进结直肠癌形成和MDSC的浸润。
3.RIPK3缺失促进MDSC的增殖活性和免疫抑制功能。
4.RIPK3缺失的骨髓细胞和MDSC显著促进结直肠癌的形成。
5.RIPK3缺失激活MDSC内NF-κB/COX-2/PGE2信号通路。
6.阻断COX-2和PGE2受体EP2抑制MDSC的免疫抑制功能，并促进结直肠癌的形成。
7.PGE2通过激活PKA-CREB轴负调控RIPK3，形成RIPK3-PGE2环路调控结直肠癌的发生。