第一部分：EV71分离鉴定及乳鼠评价动物模型的建立
　　肠道病毒71型(Enterovirus type 71， EV71)C4亚型是中国主要流行株，感染儿童引起手足口病和导致严重的神经系统疾病。EV71是引起手足口病最重要的病原因子之一，是导致0~5岁儿童手足口病重症和死亡的主要原因。目前，在临床上缺乏有效的治疗手段和抗病毒药物，开发针对EV71的疫苗是防控EV71感染最有效的手段。但由于缺乏适合的动物感染模型，疫苗和抗病毒药物的开发受到很大的阻碍。在本研究中，收集华南地区EV71感染患者的临床样品，分离获得15个临床病毒分离株，并通过VP1测序和基因组测序，确定15个病毒株属于EV71C基因型C4基因亚型。利用不同毒株接种不同日龄(1~23日龄)和不同品系(KM、Balb/C和ICR)的乳鼠，筛选获得一个高致病力的毒株EV71GZ-C2株(C2株)，该病毒株腹腔接种可感染1~19日龄KM乳鼠引起典型的EV71感染症状，感染14日龄以内的KM乳鼠导致典型的神经系统疾病症状和死亡。另外，通过比较免疫小鼠血清对各病毒株的交叉保护效果，筛选获得一株交叉保护效果最佳的EV71全病毒灭活疫苗候选病毒株(B6株)，对同一亚型病毒和EV71-BrCr株的平均蚀斑中和减少率达到97.22%。用纯化灭活的B6抗原免疫雌鼠和7日龄乳鼠以及使用EV71特异性血清治疗都能有效保护乳鼠免受EV71攻击。这些结果表明，以KM乳鼠作为实验动物，以C2病毒株为攻击株建立的EV71感染和免疫保护动物模型是一种理想的疫苗免疫原性评价和治疗性药物药效评价模型。
　　第二部分：EV71病毒样颗粒(EV71-VLPs)疫苗开发及免疫原性评价
　　病毒样颗粒(VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，保留了较全面的抗原表位，具有很强的免疫原性和生物学活性，免疫能够诱导机体免疫系统产生免疫应答，包括特异性的体液免疫、细胞免疫和交叉保护效果，高效发挥抗病毒保护作用。在本研究中，利用已经证明具有良好免疫原性的EV71临床分离株(B6株)的P1基因序列，优化其基因密码子，利用昆虫细胞-重组杆状病毒表达系统(BEVS)，构建8种不同方式的穿梭载体，转染Sf9细胞，包装获得高效表达EV71-VLPs的重组杆状病毒，比较VLPs的表达量和免疫原性，筛选获得了表达量高、免疫原性好的候选疫苗毒株。以昆虫SF-α细胞为表达宿主，利用Wave一次性生物反应器昆虫细胞培养技术大规模制备EV71-VLPs抗原，并通过已经建立的乳鼠评价动物模型和小鼠免疫评价动物模型对免疫原性(免疫攻毒保护效果、体液免疫和细胞免疫)进行评价。另外比较不同佐剂、不同抗原浓度、全病毒灭活疫苗抗原与VLPs抗原之间诱导的免疫应答的差异，结果发现，添加佐剂能够提高免疫原性，VLPs免疫能够诱导与全病毒疫苗同样水平的免疫原性。本研究开发的EV71-VLPs是一种理想的候选疫苗，该疫苗一旦能够应用于临床，将大幅度降低儿童因EV71感染导致的疾病，降低经济损失和保证儿童的生命健康，具有重要的社会意义和应用价值。